喹诺酮类药物是一类广谱抗菌的药物,广泛应用于动物疾病的预防和治疗,但其在动物源性食品中的残留严重危害消费者的健康。因此十分有必要加强对喹诺酮类的监测。目前针对喹诺酮类的监测方法主要是高效液相色谱法和毛细管电泳法等仪器方法。虽然灵敏度和准确性较高,但其用时长,成本高,前处理步骤繁琐,难以满足快速大批量的检测要求。而基于抗原-抗体反应的免疫分析方法具有操作简单,快速,灵敏和成本低等优点,适用于现场大批量的快速筛选,喹诺酮广谱免疫分析方法可同时检测两种及以上的药物,具有巨大的优势,在食品安全检测领域中的作用越来越重要,而实现广谱免疫分析关键在于获得广谱特异性抗体。本论文选取3种喹诺酮类药物为研究对象,结合结构特征进行广谱性半抗原/抗原的设计合成、多克隆抗体的制备及多种免疫分析方法研究,并探讨了喹诺酮类抗体的广谱识别机制。(1)吡哌酸为半抗原的广谱免疫分析研究吡哌酸具有喹诺酮母核结构特征,且在C-7位为广谱性药物特征结构-哌嗪环。因此选用吡哌酸为半抗原,制备吡哌酸抗体进行广谱性研究。基于异源策略建立吡哌酸免疫分析方法,半抑制浓度(IC50)为6.0 ng/mL,灵敏度明显增强。交叉反应结果显示,有18种喹诺酮类交叉反应率低于9.2%。表明吡哌酸抗体特异性较强。结合3D QSAR分析吡哌酸与广谱性药物诺氟沙星结构差异,不同于诺氟沙星C-7位哌嗪环平分于母环两侧,吡哌酸在C-7位的哌嗪环与母环在同一平面,呈“一”字型,形成抗体空腔较扁平,无法容纳导致较大的基团,是吡哌酸抗体广谱性能不佳的主要原因。此外,在N-1位带大基团或负电荷的原子影响抗体的结合亲和力。同时,应用所建立的方法研究鸡蛋中吡哌酸动态残留规律,结果显示吡哌酸在第5天达到峰值,第14天降低至100 ng/g以下。说明所建立的ELISA检测方法可用于食品中吡哌酸药物残留的检测和监控,并为吡哌酸在鸡蛋中的残留风险评估提供一定的科学依据。(2)克林沙星为半抗原的广谱免疫分析研究克林沙星与广谱性药物环丙沙星和恩诺沙星结构相似,仅在C-7位和C-8位上基团不同。与上一章吡哌酸相比,它在C-8位带有氯原子基团,可与N-1位基团相互作用形成类似环的结构。基于此,选用克林沙星为半抗原制备抗体进行广谱免疫分析研究。在同源模式下,从不同位点合成两种克林沙星示踪物。优化选择最优组合建立FPIA方法,IC50为25.6 ng/mL,灵敏度较高。特异性结果显示19种喹诺酮交叉反应率均低于5%,克林沙星抗体特异性较强。3D QSAR研究发现克林沙星在C-7位的五元环和氨基形成的空腔较小,且偏向一边,无法容纳像哌嗪环一样的大基团,是克林沙星抗体广谱性较差的主要原因。此外C-8位和N-1位非环状结构也导致克林沙星无法识别在此位点为环状结构的喹诺酮类药物。应用FPIA方法检测牛奶中克林沙星,添加回收率为97.9%~112.7%,批内变异系数均低于7.1%,高效液相色谱法(HPLC)验证显示两者具有良好的一致性。说明本方法适用于牛奶样品中克林沙星的监测和分析。基于异源竞争模式建立羊奶中克林沙星FPIA方法。设计合成克林沙星同源示踪物和五种异源示踪物,比较并筛选出异源示踪物PAZ-FITC与克林沙星抗体组合最优,FPIA法结果显示IC50为29.3 ng/mL,灵敏度明显提高,为同源组合的6倍。在羊奶中平均添加回收率为96.6%,平均变异系数为5.3%,可满足快速检测的需求。说明基于异源策略的FPIA方法是一种快速、高通量的检测方法,可用于羊奶样品中克林沙星的监测和分析。此外,发现帕珠沙星作为异源示踪物可提高抗体亲和力和特异性,因此,在之后选用帕珠沙星作为半抗原进行抗体制备和性能研究。(3)帕珠沙星为半抗原的广谱免疫分析研究不同于大部分喹诺酮类药物带有哌嗪环,帕珠沙星在C-7位的基团为氨基环丙基,且在C-8位和N-1位为氧氮杂环,可能可提高广谱性。本研究选用帕珠沙星制备多克隆抗体。优化条件选择最优组合建立高灵敏的ELISA方法,结果显示所建立的ELISA方法IC50为10.3 ng/mL,灵敏度较高。特异性分析结果显示帕珠沙星抗体可识别24种喹诺酮类药物,具有广谱性。应用3D QSAR分析发现立体场对抗体识别起主要作用,在C-7位的氨基和环丙基形成的V形结构可形成较大空腔,是帕珠沙星抗体具有广谱识别性能的主要因素,在C-8位和N-1位为氧氮杂环,有利于识别在相同位置为环状或类似环状结构的喹诺酮类,在N-1位上带大基团不利于抗体的结合亲和力。综上所述,本研究选用吡哌酸、克林沙星和帕珠沙星3种喹诺酮药物为对象,偶联制备多克隆抗体进行广谱性免疫分析研究,应用3D QSAR分析发现立体场对抗体识别起主要作用,C-7位的基团对应抗体空腔的大小是影响抗体广谱识别性能的主要因素。在C-8位和N-1位的环状结构有利于提高抗体广谱性,在N-1位上带大基团不利于抗体的结合亲和力。