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厚壳贻贝(Mytilus coruscus)是我国重要的水产养殖品种之一,近年来随着海洋环境不断恶化,海洋贝类微生物污染越来越普遍,严重影响了贻贝健康养殖的需求。此外,微生物病原菌(例如海洋弧菌等)引起的贝类疾病时常发生,从而造成巨大的经济损失。从厚壳贻贝的免疫系统着手,深入研究厚壳贻贝免疫预防机制,探讨提高贻贝抗病能力的有效方法,是保持厚壳贻贝养殖业健康发展的必经之路。Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是无脊椎动物重要的模式识别受体之一,可识别多种病原微生物及其他非己物质,而髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是TLR信号通路中与TLR直接作用的接头分子,两者在激活后续的一系列免疫反应中有重要作用。本研究基于厚壳贻贝外套膜转录组数据,鉴定了54个TLR基因并对其进行初步分析;克隆了两个TLR基因和一个MyD88基因cDNA全长,对它们的具体结构和功能进行了研究;此外,探索了两个TLR基因在厚壳贻贝发育过程中的作用。主要结果如下:1.从厚壳贻贝外套膜转录组中鉴定TLR基因及其初步分析厚壳贻贝外套膜转录组中共鉴定到54个TLR基因,分别命名为TLR1-54,它们在结构上均包括LRR结构域、跨膜区和TIR结构域。经SMART预测,54个TLR中LRR的数量在1-19之间不等,32个TLR具有C端LRR结构(LRRCT),16个具有N端LRR结构(LRRNT),9个TLR同时具备LRRCT、LRRNT和信号肽。系统进化树结果显示,这54个TLR形成两个主要的分支(A分支和B分支),进而可再细分为六个亚家族(A1、A2、B1、B2、B3、B4)。从每个亚家族下随机挑选一个TLR基因,检测它们在各发育阶段和成体组织中的表达情况。被检测的六个LTR基因在不同发育阶段的表达趋势基本相同,都在稚贝阶段有显著升高;在成体组织中,除了TLR31在足中没有表达,其他LTR基因在各组织中均有表达。2.两个TLR基因cDNA全长序列的克隆及结构分析通过RACE克隆,我们获得了两个TLR基因(McTLR2和McTLR3)的全长序列。McTLR2基因cDNA全长3968 bp,包括5’非编码区(UTR)71 bp,3’UTR1805 bp和一个2091 bp的开放阅读框(ORF),编码696个氨基酸。预测蛋白的分子量为80.90 kDa,等电点(pI)为9.35。McTLR2氨基酸序列包含1个信号肽、6个LRR结构域、1个LRR-CT、跨膜区和1个TIR结构域。McTLR3基因cDNA全长4568 bp,包括5’UTR 258 bp,3’UTR 1691 bp和一个2619 bp的开放阅读框(ORF),编码872个氨基酸。预测蛋白的分子量为98.97 kDa,等电点(pI)为9.20。McTLR3氨基酸序列包含1个信号肽、13个LRR结构域、1个LRR-NT、4个LRRTYP、1个LRR-CT、跨膜区和1个TIR结构域。3.两个TLR基因细菌感染后的表达分析我们通过注射沙氏弧菌(Vibrio chagasii)和沙氏弧菌水体暴露两种感染方式刺激厚壳贻贝,结果发现,暴露于含沙氏弧菌水体的厚壳贻贝,McTLR2和McTLR3在血细胞和外套膜中的基因表达量均显著升高,表明McTLR2和McTLR3能识别弧菌,并参与了机体清除细菌的免疫反应;且外套膜中的基因上调明显早于血细胞中基因的上调时间。说明外套膜是贝类免疫的第一道防线,能第一时间感知到外界病原菌并作出免疫反应。然而,注射细菌对McTLR2只起到微弱的反应,甚至使McTLR3表达量降低。但血清中SOD、CAT和溶菌酶活性显著升高,说明机体中免疫相关酶参与到了抵抗细菌的反应中。4.MyD88基因cDNA全长序列的克隆及结构分析通过RACE克隆了MyD88基因cDNA全长序列(命名为McMyD88-4),该基因cDNA全长3930 bp,包括188 bp的5’UTR,2607 bp的ORF编码区和1135 bp的3’UTR。该基因总共编码868个氨基酸,包含一个死亡结构域(DD)和一个TIR结构域,预测其蛋白质分子量为97.074 kDa,等电点为5.32。经RT-qPCR检测发现,McMyD88-4基因在厚壳贻贝各组织和器官中均有表达,其中在外套膜和鳃中的表达量最高。经V.chagasii水体暴露感染后,厚壳贻贝外套膜、鳃和消化腺中McMyD88-4基因均有快速而明显的上调,在3 h或6 h达到峰值,推测McMyD88-4通过TLR信号通路参与了贻贝抵抗弧菌的免疫反应。在消化腺中基因的上调水平明显高于鳃和外套膜,表明厚壳贻贝消化腺对于沙氏弧菌的免疫反应可能比鳃和外套膜更敏感。5.两个TLR基因在厚壳贻贝发育过程的作用研究我们采用不同诱导活性细菌的微生物被膜诱导眼点幼虫附着变态,检测了诱导不同时间点幼虫的McTLR2和McTLR3表达情况。结果表明,在光伏希瓦氏菌Shewanella loihica(高诱导活性)菌膜诱导过程中,McTLR2基因表达量有先下降后上升的趋势,而McTLR3基因表达量无明显变化;在假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.4(低诱导活性)菌膜诱导过程中,McTLR2基因在48 h有显著升高,McTLR3基因则在6 h、12 h和48 h表达量都较高。两个基因在不同细菌微生物被膜诱导后表现出不同的表达模式,猜测这与细菌的种属有关。而在变态过程中TLR基因被上调,猜测TLR可能调控幼虫旧组织蜕化、吸收或新组织的再生过程。