一、研究背景与目的脊髓损伤常导致患者肢体瘫痪,严重者甚至导致死亡。由于目前还没有有效的治疗手段,逐年增加的脊髓损伤患者已成为世界各国重大的经济负担。仅根据美国相关调查报道,每年用于脊髓损伤患者治疗和护理的费用就超过70亿美元,而且患者的平均年龄为31.7岁,15至25岁为发病高峰年龄段,后期还需要长久的治疗和护理。可见脊髓损伤治疗的研究有着极其重大的社会意义。脊髓损伤的病理过程包括原发性损伤和继发性损伤,脊髓的继发性损伤在原发性损伤的基础上发生,缺血再灌注损伤和炎症反应所产生的细胞外毒素、自由基和炎症介质等引发神经细胞坏死和凋亡是脊髓继发性损伤的病理基础。研究发现,氢具有中和自由基的作用。由于其电中性,容易渗透细胞膜和细胞内膜,氧化后生成水,且在清除自由基的同时不会造成机体氧化还原代谢的紊乱,能有效改善心、脑、肝、肺、肾等重要脏器的缺血再灌注损伤。用氢治疗动物脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemic reperfusion injury, SCII)的研究相对少见,2014年本课题组在氢水治疗动物(新西兰大白兔)脊髓缺血再灌注损伤的研究基础上发表文献,研究结果发现经氢水治疗后,动物神经功能明显改善,凋亡细胞数量明显下降,氢能降低氧化产物的产生,获得有效的治疗效果,与相关研究报道的结果相一致。氢除了具有还原自由基的功能外,可能还通过其他途径抑制神经细胞凋亡。现有文献资料均未对氢抑制神经细胞凋亡的机制进行明确的探讨,因此,氢作为一种有效治疗脊髓损伤的潜在药物,对其抑制神经细胞凋亡的作用机制的研究显得尤为必要。目前关于氢抑制细胞凋亡相关通路的研究较少,Zhang等研究发现氢可以增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的表达及减少活性氧族(reactive oxygen species, ROS)的表达,具有抗炎抗氧化作用。Zhao Y等在2014年研究发现氢盐水可通过抑制内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用,其作用机制可能与减少心肌组织中GRP78、caspase-12及Bax等凋亡蛋白的表达、增加抗凋亡因子Bcl-2水平有关。Chen ZF等研究发现H2S可以增加抗氧化酶SOD的表达及减少ROS的表达,通过调节内质网应激起到抗炎、抗氧化作用。Li C等在2016年发表的实验研究发现H2S可以抑制氧葡萄糖剥脱／再恢复(oxygen-glucose deprivation/restoration, OGD/R)诱导的PC12细胞凋亡。H2S与氢都具有相同的成分氢分子,因此在脊髓损伤的治疗作用中,氢可能通过抑制内质网应激相关凋亡途径对神经细胞起到保护作用,从而抑制神经细胞凋亡。PC12细胞是一组由大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆而来的细胞系,具有神经内分泌细胞的一般特性,且具有可传代特点,因此分化的PC12细胞常作为体外细胞模型用来研究神经元细胞的生理、生化功能。Vavilis T等在2015年研究发现,OGD可以通过调节PC12细胞内质网上的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),促使PC12细胞自我吞噬导致细胞凋亡。为了体外模拟脊髓缺血再灌注损伤的病理生理过程并探索氢抑制神经细胞凋亡的可能机制,我们应用OGSD/R (oxygen-glucose-serum deprivation/restoration)模型诱导PC12细胞凋亡,通过凋亡模型的建立及明确氧糖血清再恢复后细胞凋亡的时间窗,为氢干预提供实验依据,并进一步验证氢是否能够通过内质网应激相关凋亡通路抑制PC12细胞凋亡二、研究方法(一)PC12细胞的传代培养及鉴定PC12细胞购自中科院上海细胞库(高分化型)。PC12细胞经过复苏、贴壁并增殖,传至第三代取对数生长期的细胞用于实验研究。经传代的细胞在生物倒置显微镜下观察其形态并拍照。(二)实验分组第一部分：正常组(正常培养的PC12细胞),实验组(OGSD 12h/R 0-6h)第二部分：正常组(正常培养的PC12细胞),对照组(OGSD/R组,仅氧糖血清剥脱/再恢复,无干预),氢治疗组(于复氧复糖复血清即刻给予氢干预)(三)OGSD/R模型的建立将PC12细胞置于低糖不含血清的DEME培养基中,并将培养板置于三气培养瓶中(94% N2+5% CO2,1% O2)中培养,12h后取出细胞并换成高糖DEME培养基,于复氧复糖复血清后不同时间点观察并记录细胞凋亡情况及相关蛋白检测。(四)氢培养基的制备无菌操作下,向铝袋内注入高糖DEME培养基,4℃保存。实验前取出培养基,利用高压通气装置,通入过滤氢气(0.4MPa,6h),使氢气充分溶解在培养基中达到饱和状态(浓度>0.6mmol/L)。氢气每三天补充以维持其饱和浓度,配好的氢培养基放于4℃冰箱保存,实验前取出。(五)免疫荧光检测第一部分：于OGSD 12h/R 0-6h取不同时间点行细胞DAPI染色,镜下观察各组细胞凋亡情况并拍照。第二部分：于OGSD 12h/R 1h对三组细胞行DAPI染色,镜下观察细胞凋亡并计算凋亡率。(六)细胞活性检测应用CCK8检测试剂盒检测各组细胞相对活性并行相关统计学分析,比较各组细胞活性差异。(七)流式细胞学方检测细胞凋亡率流式细胞仪检测各组细胞凋亡率并行相关统计学分析,比较各组细胞凋亡变化及差异。(八)细胞内ROS水平检测应用H2DCF-DA探针检测氢干预后三组细胞内ROS表达,流式细胞仪分析并行相关数据收集。(九)相关凋亡蛋白检测Western-blot法检测caspase-3,caspase-12, PERK-eIF2α-ATF4, CHOP/GADD153水平的表达,比较各组凋亡相关蛋白的水平表达差异。三、结果(一)细胞经传代后,在倒置显微镜下观察PC12细胞形态完整,长出类似交感神经元样的突起,细胞体积增大呈梭形,彼此相互连接交错。(二)为了更好的观察细胞凋亡形态的变化,我们对正常培养的PC12细胞及复氧复糖复血清后0-6h各时间点细胞行 DAPI染色,结果提示在正常未处理的PC12中细胞凋亡几乎不存在,经过氧葡萄糖血清剥脱12h后PC12细胞凋亡增加。给予氧糖血清再恢复后PC12细胞凋亡进一步增加,细胞损伤进一步加重,在氧糖血清再恢复后1h时细胞凋亡最重。通过细胞活性检测及流式细胞学分析并行相关统计学分析,结果与DAPI染色结果相一致。(三) western-blot方法检测凋亡蛋白caspase-3, caspase-12的表达结果提示,在正常未处理的PC12细胞中caspase-3, caspase-12的表达比较低,氧葡萄糖血清剥脱后PC12细胞中的caspase-3, caspase-12被诱导活化,表达增加。经过氧糖血清再恢复后,caspase-3, caspase-12的表达进一步增加,细胞损伤进一步加重。Caspase-12的含量在氧糖血清再恢复后1h达到峰值。Caspase-3的含量在氧糖血清再恢复后2h达到峰值。两种凋亡蛋白的表达趋势基本一致。(四)在氧糖血清再恢复时预先给予氢处理能够减少PC12细胞的进一步损伤,抑制细胞凋亡,促进细胞的存活。通过细胞DAPI染色及细胞活性检测,结果提示在氧糖血清恢复1h时,氢治疗组细胞形态较对照组完整,凋亡细胞较少,细胞活性明显高于对照组,且差异有统计学意义。行Western-blot方法检测各组PC12细胞内cleaved-caspase-3, caspase-12, CHOP/GADD153及p-PERK, p-eIF2α, ATF4蛋白水平表达结果提示,正常未处理的空白组PC12细胞内cleaved-caspase-3,caspase-12, CHOP/GADD153及p-PERK, p-eIF2a, ATF4蛋白水平表达较低,对照组细胞内cleaved-caspase-3, caspase-12, CHOP/GADD153及p-PERK, p-eIF2a, ATF4蛋白表达较高,细胞损伤较重。经过氢预处理的实验组PC12细胞内cleaved-caspase-3, caspase-12, CHOP/GADD153及p-PERK, p-eIF2a, ATF4蛋白水平表达较对照组明显降低,且各组之间比较差异有统计学意义。四、结论氧葡萄糖血清剥脱可以诱导PC12细胞的凋亡,并在氧糖血清再恢复后导致PC12细胞损伤进一步加重,OGSD/R诱导的PC12细胞凋亡具有时间依赖性。预先给予氢处理可以抑制内质网应激相关凋亡蛋白的表达,提高细胞活性,进而减少PC12细胞的损伤,抑制细胞凋亡。本实验通过体外细胞实验证明了氢可以通过抑制内质网应激相关凋亡通路的活化对脊髓缺血再灌注损伤导致的神经细胞凋亡起到保护作用。