研究背景前列腺癌是目前全世界范围内成年男性发病率第一的恶性肿瘤,在部分地区死亡率也排在第二位,其发病率和发病特征在多个国家中显示出了明显的不同,欧美人群当中发病率较高,而亚洲人群发病率较低,但是近年来包括中国等亚洲国家在内,前列腺癌的发病率却不断上升,在中国已跃居男性恶性肿瘤的前十位。近年来,人们日益认识到,传统的临床和病理学诊断指标等,已经不能完全用于预测患者前列腺癌预后,需要更多的从更加深入的分子层面加深对前列腺癌的认识。因此,面对着前列腺癌发病率的不断升高和东西方前列腺癌人群特征的明显差异,从分子层面探索影响前列腺癌发病的关键因子,寻找可以有效预测前列腺癌患者预后的分子标志物,并探索其影响前列腺癌发生发展的信号通路就显得尤为重要。研究目的:本课题主要是基于前期本课题组的中国人前列腺癌多组学测序研究结果,探索与前列腺癌恶性进展密切相关的信号通路,发现与前列腺癌恶性进展密切相关基因,并探索其中发现的PLXNA1对前列腺癌恶性增殖、侵袭和迁移能力的影响。通过中国人群和欧美人群前列腺癌根治术后样本研究其对前列腺癌预后的预测和判断作用。通过生物信息学、细胞生物学实验等多种方法,研究PLXNA1促进前列腺癌恶性进展的分子机制及其在前列腺癌当中的相关调控研究。研究方法:我们通过对本研究中前列腺癌的测序数据,针对其中发生高频改变的基因组变化(包括体细胞突变,拷贝数和结构变异等)等进行了研究,综合分析筛选出新的可能影响前列腺癌恶性进展的的信号通路,并筛选出其中对前列腺癌恶性进展可能起到重要作用的分子。针对筛选出来的分子,利用公共数据资源实施联合分析,验证其在不同前列腺癌样本当中出现扩增的情况,以及其在何种特殊类型的前列腺癌样本中出现高频扩增。随后针对相关前列腺癌亚型,不同肿瘤临床分期,不同病理Gleason评分,以及在癌和癌旁,转移与非转移前列腺癌中进行其表达量的关联分析。通过外源导入过表达质粒,通过shRNA,siRNA等敲低该基因在前列腺癌中的表达,探索其对前列腺癌的增殖能力、侵袭能力和迁移能力的影响。通过建立裸鼠皮下荷瘤模型,探索其对裸鼠皮下荷瘤模型增殖的影响。通过免疫组织化学染色探索其对裸鼠皮下荷瘤细胞中影响前列腺癌恶性进展的关键分子的表达量的影响。通过入组中国和欧美两个不同人群中前列腺癌根治样本,并对其临床信息进行收集,对其根治手术后的前列腺癌生化复发、肿瘤转移和总体生存情况进行随访分析。通过免疫组织化学染色的方法研究其在前列腺癌根治术后样本中的表达情况,通过Kaplan-Meier法(又称乘积极限法,product-limited method,简称KM法)分析其表达量与患者预后(包括患者的生化复发、远处转移和总体生存时间)的关系,通过log-rank检验分析其高表达和低表达组患者预后的统计学差异,通过Cox比例风险回归模型,通过单因素分析和多因素分析的方法,分析各纳入研究的影响因素(包括既往报道可能影响前列腺癌患者预后的Gleason评分,术前PSA值,AJCC肿瘤T分期,术后切缘情况),判断其表达对患者生存时间(包括患者的生化复发、远处转移和总体生存时间)的影响情况,同时计算相对危险度。判断其能否作为监测患者术后肿瘤复发、进展和影响患者生存以后的重要因素,以更好的对高危患者进行密切监测和早期临床干预,为未来进一步前瞻性的临床实验打下基础。通过生物信息学和蛋白免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)实验,综合分析与其相互作用的蛋白,分析其可能影响的下游信号通路的改变,通过过表达外源基因和shRNA敲低实验,通过蛋白免疫印迹实验(Western Blotting,WB)、IP实验、乳酸生成实验等发现并验证其改变对下游信号通路改变的影响。通过生物信息学实验、体内泛素化实验、药物处理和蛋白半衰期检测实验,发现与其相互作用、影响其蛋白水平的分子,并进一步分析其对下游信号通路的影响。研究结果:在本研究当中,我们通过多组学的数据分析,发现中国男性前列腺癌中基因组突变的情况与TCGA(以欧美男性为主)存在一些类似之处,但是也有着显著不同,一些基因的改变和表达有较大差别。进一步的,我们通过多途径综合分析,发现在前列腺癌中Axon Guidance信号通路发生高频改变,与前列腺癌的恶性进展密切相关。进一步的,我们发现Axon Guidance信号通路当中的PLXNA1出现高频改变,并且多个数据库的数据综合分析显示,PLXNA1表达量与患者前列腺癌恶性程度密切相关,促进前列腺癌的恶性进展。我们通过在前列腺癌细胞当中进行过表达和敲低实验,发现敲低PLXNA1后,会明显降低前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移的能力,而过表达PLXNA1则会促进前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移的能力,并且PLXNA1会影响前列腺癌细胞增殖、上皮间质转化和神经内分泌分化相关指标的变化。进一步的动物实验也验证了这一结果。针对这个我们新发现的前列腺癌致病基因PLXNA1,我们又通过在中国人群(419例患者,中位随访时间为52个月)和欧美人群(213例患者,中位随访时间16.4年)的两个独立的前列腺癌根治样本中,通过免疫组化探索其中PLXNA1蛋白的表达差异,通过该大样本人群的随访验证,发现PLXNA1是鉴别前列腺癌恶性程度的一个重要因素,经过单因素和多因素分析,发现PLXNA1是患者前列腺癌根治术后生化复发、肿瘤转移和总体生存的独立危险因素。可以作为在前列腺癌根治术后鉴别肿瘤复发、转移的高危因素,有助于对高危患者进行密切监测和早期临床干预。在进一步的机制和调控研究当中,我们发现PLXNA1通过与OS-9蛋白相互作用,PLXNA1高表达后,通过与OS-9的相互作用的增强,降低HIF-1α(Hypoxia inducible factor-1α)与OS-9的相互作用,阻遏OS-9其对HIF-1α的降解的促进作用。体内实验表明PLXNA1升高会明显促进HIF-1α蛋白的稳定性,使其蛋白水平升高。而敲低PLXNA1表达,会明显降低HIF-1α的蛋白水平,并且会进一步引起HIF-1α下游有氧糖酵解和相关调控信号通路中多个关键酶如Hexokinase I(HXK I),GLUT-1,PDK-1,PKM,LDH,GLUT-1,VEGF的改变,促进有氧糖酵解过程,促进肿瘤的营养和能量代谢的改变。我们通过蛋白免疫共沉淀实验验证PLXNA1与Smurf2(SMAD Specific E3Ubiquitin Protein Ligase 2)存在相互作用,进一步,我们通过蛋白免疫共沉淀实验和体内泛素化实验以及特异性药物处理等,综合分析发现Smurf2是与PLXNA1相互作用的E3泛素连接酶,可以促进PLXNA1的泛素化降解,并且进一步影响PLXNA1-HIF-1α及其下游有氧糖酵解信号通路关键酶的变化,调节肿瘤代谢。研究结论:本研究通过中国人群前列腺癌测序研究,筛选出Axon Guidance信号通路中PLXNA1是前列腺癌恶性进展中的重要调控因子,可以促进前列腺癌的增殖、侵袭和迁移能力,生物信息学分析也显示PLXNA1表达量与患者前列腺癌恶性程度密切相关。来自东西方两个独立的前列腺癌根治术样本人群的数据验证,发现肿瘤组织当中PLXNA1表达量是患者前列腺癌根治术后生化复发、肿瘤转移和总体生存的独立危险因素。可以作为在前列腺癌根治术鉴别术后肿瘤复发、转移的高危因素。进一步的机制研究表明,PLXNA1的蛋白水平在上游受到HECT家族E3泛素连接酶Smurf2的调控,Smurf2可以促进PLXNA1泛素化降解,而PLXNA1在其下游可以通过与OS-9蛋白结合,阻遏OS-9对HIF-1α的降解,从而在蛋白水平稳定HIF-1α,并且促进下游有氧糖酵解信号通路关键酶的变化,调节肿瘤代谢。综上所述,我们从多个层面研究了PLXNA1促进肿瘤恶性进展的作用和机制,并研究了其在前列腺癌中的调控机制,以及其对患者生存预后的作用,为其进一步的研究和临床转化应用,为进一步的探索新的前列腺癌的治疗靶点,提供新型临床诊疗方案提供了可信赖的理论依据。