【摘 要】
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为了研究一种准确、灵敏和快速的鉴别型布鲁氏菌检测技术,解决生产实践中缺少识别布鲁氏菌疫苗免疫畜群中布病患畜方法,检疫净化工作难以开展的难题。本研究结合Taq Man探针法实时荧光定量PCR技术,针对布鲁氏菌A19疫苗株ABC转运蛋白渗透酶基因WP788.1缺失片段、流产布鲁氏菌株NC7250缺失基因和布鲁氏菌外膜蛋白BP26基因设计引物探针,开展了布鲁氏菌qPCR和多重qPCR检测方法研究。研究结
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为了研究一种准确、灵敏和快速的鉴别型布鲁氏菌检测技术,解决生产实践中缺少识别布鲁氏菌疫苗免疫畜群中布病患畜方法,检疫净化工作难以开展的难题。本研究结合Taq Man探针法实时荧光定量PCR技术,针对布鲁氏菌A19疫苗株ABC转运蛋白渗透酶基因WP788.1缺失片段、流产布鲁氏菌株NC7250缺失基因和布鲁氏菌外膜蛋白BP26基因设计引物探针,开展了布鲁氏菌qPCR和多重qPCR检测方法研究。研究结果如下:（1）参考WP788.1、NC7250和BP26基因序列设计引物和探针,通过筛选引物探针、优化反应体系内引物与探针的终浓度,建立了3种布鲁氏菌单重qPCR检测方法。3个基因qPCR检测方法灵敏性均为10 copies/μL,相比常规PCR灵敏性提高了100倍;检测方法能检测不同种型布鲁氏菌及疫苗株对应的基因,与常见的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和链球菌无交叉反应,具有较好的特异性和重复性。（2）通过将3种布鲁氏菌单重qPCR检测方法进行两两组合验证引物与探针之间的相容性和最佳配比,优化并建立了针对3个布鲁氏菌特异性基因的三重qPCR检测方法。三重qPCR方法对3种目的片段检测灵敏性分别为WP788.1 100 copies/μL、NC7250 10 copies/μL和BP26 10 copies/μL;重复性检测组内与组间变异系数均小于1.1%;能有效区分布鲁氏菌A19/S19疫苗株和其他种型布鲁氏菌,也可区分牛种布鲁氏菌和非牛种布鲁氏菌。以建立的三重qPCR检测方法对采集的53份临床血样进行检测,共检出布鲁氏菌阳性样本46份,其中牛种布鲁氏自然毒株2份,未检到布鲁氏菌A19/S19疫苗核酸,与样本的免疫背景相符。成功建立了多个鉴别型布鲁氏菌qPCR检测方法,检测方法具有较好的特异性、灵敏性和可重复性,可用于临床布鲁氏菌病的鉴别诊断。
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