宫颈癌(cervical cancer)是妇女最常见的恶性肿瘤,全球每年约有470000新发病例,大约有233000死亡病例。近年来发达国家宫颈癌的发病率有所下降,然而在包括中国在内的发展中国家其发病率仍很高,是女性致死的第二大疾病。根治性子宫切除结合淋巴结清扫术和骨盆外放疗结合腔内精确定位的放疗可以明显提高早期宫颈癌患者的生存率,然而中晚期肿瘤目前的主要疗法是放化疗结合治疗且效果很差,是导致患者死亡的主要原因。细胞与细胞或细胞与细胞外基质的结合位点即粘着斑发生了改变可能是晚期肿瘤组织局部浸润和远处转移机制之一。粘着斑激酶(Focal Adhesion Kinase, FAK)是一种在整合素介导的信号转导通路中起着至关重要的作用的非受体酪氨酸激酶,与肿瘤细胞的生存、增殖、侵袭、迁移、血管生成、淋巴结转移、肿瘤干细胞形成、肿瘤微环境和上皮间质转变等过程密切相关。然而FAK在宫颈癌中作用及具体机制不明。MicroRNAs (miRNAs)是一类非编码、具调控功能的小分子单链RNA,参与机体的生长、发育、分化、代谢和死亡等几乎所有重要的生理过程。miRNA能够结合靶mRNA3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)区,并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和(或)抑制翻译过程而发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用,成为人类某些肿瘤的潜在标志物。有研究显示,miR-7作为抑癌基因在多种肿瘤(包括宫颈癌)的增殖及迁移中起作用,且生物信息学提示FAK 3’UTR和miR-7在多种生物物种中存在保守性绑定结合位点,那么在宫颈癌细胞中miR-7是否能通过靶定FAK基因影响细胞的增殖及迁移,值得进一步研究。最新有研究指出,环状RNA (circular RNA, circRNA)具有竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA, ceRNA)的功能,能与miRNA竞争性结合mRNA3’UTR区的miRNA识别元件(microRNA recognition element, MRE),能够屏蔽miRNA对靶mRNA的抑制或者降解作用,从而调节靶基因mRNA及其蛋白的表达。已有研究显示,在鼠神经组织细胞中高表达的小脑变性相关蛋白1反义转录物(antisense to the cerebellar degeneration-related proteinl transcript, CDRlas),也叫做环状RNA-7 (ciRS-7),包含了70多个miR-7的识别位点可以抑制miR-7活性而提高miR-7靶基因表达。那么在宫颈癌细胞中ciRS-7与miR-7是怎样的调节关系,能否通过与miR-7竞争性结合而调节miR-7靶基因的表达,迄今为止未见相关文献报导。紫草素(shikonin)是从紫草科植物紫草的根中提取出的一种有效成分,其化学结构为萘醌类化合物,具有抗炎、抗肿瘤等作用。研究报道紫草素可以抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。然而关于紫草素对宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力的具体作用机制尚未明确。本研究选用人宫颈癌细胞为研究对象,拟研究FAK在宫颈癌中的表达及意义；研究ciRS-7与miR-7是否可以通过FAK通路对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移产生作用；研究中药单体紫草素对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用,并探讨其机制是否与抑制FAK通路有关等。研究内容分为四部分：第一部分FAK在宫颈癌中的表达及临床意义目的：研究粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)在正常宫颈组织和宫颈癌组织中的表达情况,探讨其与宫颈癌发生发展、侵袭及转移的关系。方法：用免疫组织化学SP方法和实时定量PCR方法检测47例宫颈癌及35例正常宫颈组织的石蜡标本和活检新鲜冰冻标本中FAK的mRNA和蛋白的表达情况。结果：1、FAK在正常宫颈组织低表达,在宫颈组织中表达高,两组相比较差异有显著意义(P<0.05)。2、FAK在宫颈癌FIGO临床分期III-IV期中比Ⅰ-Ⅱ期表达高,差异有显著意义(P<0.05)。3、FAK在宫颈癌浸润深度>1/2组织中较浸润深度<1/2组织中表达高,差异有显著意义(P<0.05)。4、伴有淋巴结转移组的宫颈癌组织比不伴有淋巴结转移组FAK的表达量显著增高,两组比较有统计学差异(P<0.05)。结论：FAK的表达随宫颈癌病变的发展而逐渐增高,可能参与了宫颈癌的发生发展、侵袭、转移过程,可作为判定早期宫颈癌向中晚期进展的高危指标之一,为宫颈癌的早期诊断及预后判断提供了新的分子标靶。第二部分miR-7通过FAK通路抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移的机制研究目的：研究miR-7对人宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并探讨其机制是否与靶定FAK相关。方法：构建人：miR-7-MSCV-PIG质粒,在人宫颈癌Hela和C33A细胞系中过表达miR-7,用流式细胞术检测GFP来检测：miR-7-MSCV-PIG质粒在宫颈癌Hela和C33A细胞中的转染效率,并间接显示miR-7对宫颈癌细胞的增殖影响；用CCK8实验来检测miR-7对宫颈癌Hela和C33A细胞的增殖影响情况；用transwell小室检测过表达miR-7的宫颈癌Hela和C33A细胞的侵袭、迁移情况；利用生物信息学方法预测出FAK是miR-7的靶基因,构建FAK-PGL3质粒,在293T细胞中用双荧光素酶报告基因方法验证miR-7对其靶基因FAK的直接调控作用；通过实时定量PCR方法和Western blotting方法检测过表达miR-7的宫颈癌Hela和C33A细胞中miR-7靶基因FAK的mRNA和蛋白水平的表达变化,进一步确定miR-7对FAK的调控作用。结果：1、在宫颈癌Hela、C33A细胞中,转染miR-7-MSCV-PIG质粒组相比MSCV-PIG组(阴性对照组),miR-7的表达明显增高(P<0.05)。2、在过表达miR-7的宫颈癌Hela、C33A细胞中,反应细胞增殖活性的GFP荧光逐渐减弱(P<0.05)。3、在过表达miR-7的宫颈癌Hela、C33A细胞中,细胞的增殖能力受到明显抑制(P<0.05)。4、在过表达miR-7的宫颈癌Hela、C33A细胞中,细胞的侵袭及迁移能力受到明显抑制(P<0.05)。5、生物学信息提示,在包括人在内的多种生物细胞中FAK 3’UTR区与miR-7具有保守性结合位点,双荧光素酶报告实验表明miR-7能够通过作用于FAK基因的3’UTR区的特定位点对其表达进行负性调节。6、在过表达miR-7的宫颈癌HeLa和C33A细胞中,FAK基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显下降。结论：过表达miR-7抑制了宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移,其机制可能与靶定FAK基因相关,进一步阐明了FAK及与其绑定的miR-7参与了宫颈癌的发生发展、侵袭、转移过程,可作为新的分子标靶干预宫颈癌的治疗及预后。第三部分ciRS-7竞争性结合miR-7调节FAK通路促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移的机制研究目的：研究ciRS-7、miR-7在宫颈癌组织中的表达及相互关系,探究ciRS-7对人宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并探讨其机制是否与miR-7及其靶基因FAK相关。方法：实时定量PCR方法检测人宫颈癌组织及正常宫颈组织中miR-7、ciRS-7的表达,并分析两者表达的相关性。在宫颈癌Hela细胞系中,分别过表达miR-7、ciRS-7,并用实时定量PCR技术分别检测宫颈癌细胞中的ciRS-7、miR-7的表达。在过表达ciRS-7的宫颈癌Hela和C33A细胞系中,用台盼蓝细胞计数检测细胞的增殖情况；用transwell小室检测细胞的侵袭、迁移情况；用实时定量PCR方法、Western blotting法分别检测细胞中FAK的mRNA及蛋白的变化情况。结果：1、miR-7在人宫颈癌组织中的表达明显低于正常宫颈组织,而ciRS-7在人宫颈癌组织中的表达高于癌旁组织(P<0.05),且miR-7、ciRS-7在宫颈癌中的表达存在明显的负相关性(r=-0.644,P<0.05)。2、在宫颈癌细胞Hela细胞中,分别过表达miR-7、 ciRS-7后,ciRS-7与miR-7的表达水平降低。3、在宫颈癌细胞Hela和C33A细胞中,过表达ciRS-7后,促进了细胞的增殖以及侵袭迁移能力,并且提高了细胞中的FAK的mRNA及蛋白水平。结论：在宫颈癌组织和细胞中miR-7与ciRS-7的表达存在明显的负相关性,且ciRS-7可能通过与FAK竞争性结合miR-7而上调了FAK的表达,从而促进了宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移,针对该RNA调节网络的分子靶向治疗有望为宫颈癌的诊断和治疗提供新的方向。第四部分紫草素可能通过FAK通路抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移的作用机制研究目的：研究紫草素(shikonin)对人宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并对其机制进行初步探讨。方法：体外培养Hela细胞,分为对照组和紫草素组(质量浓度分别为4,8,16,32,64μmol-L-1),采用MTT法检测紫草素对Hela细胞增殖的抑制作用；采用流式细胞术观察紫草素处理Hela细胞24 h后,细胞凋亡率的变化;Transwell小室法检测处理24 h后细胞侵袭和迁移力的变化；Western blotting法分析处理24h后FAK蛋白表达及FAK磷酸化水平的变化；实时荧光定量PCR技术检测处理24 h后FAK mRNA表达的情况。结果：紫草素对Hela细胞的增殖具有抑制作用,且具有浓度和时间依赖性；细胞凋亡率随着紫草素浓度的增加而逐步增高；其中32,64μmol·L-1的紫草素可明显抑制细胞增殖并诱导其凋亡(P<0.01)。4,8,16 μmol·L-1的紫草素作用于Hela细胞后,能够显著降低Hela细胞的穿膜细胞数(P<0.05)。紫草素能够呈浓度依赖性的下调Hela细胞中FAK蛋白和mRNA的表达,使FAK磷酸化水平降低。结论：紫草素可显著抑制Hela细胞的增殖、侵袭和迁移能力,其机制可能与抑制FAK通路有关,为中医药治疗宫颈癌提供了新的思路。综上,FAK表达的上调可能是宫颈癌的发生发展及浸润转移机制之一；FAK是miR-7的靶基因之一,miR-7可通过靶定FAK抑制宫颈癌的增殖、侵袭及迁移；而ciRS-7可通过与miR-7结合而上调FAK的表达,从而影响宫颈癌的增殖、侵袭及迁移；中药单体紫草素可能通过抑制FAK通路对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移也有抑制作用。本研究探讨了ciRS-7/miR-7/FAK调节轴对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响,有望为宫颈癌的诊断和治疗提供新的分子标靶,并试图结合中药干预治疗,为中西医结合治疗宫颈癌提供新的科学理论基础。