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乳腺癌（breast cancer）作为一种高度异质性疾病,根据分子标志物雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,H E R 2）表达的差异分为多个分子亚型。自噬（autophagy）是存在于细胞中的一种溶酶体降解途径,为维持细胞存活、生长、分化和稳态所必须。最近大量的研究表明,自噬与肿瘤关系密切,并在肿瘤发生发展过程中可能扮演着促癌和抑癌的双重角色。蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferase,PRMT）主要包含9个家族成员,作为一种常见酶类存在于哺乳动物中,参与基因转录调控、信号转导通路、DNA损伤修复及m RNA剪接等多种生物学过程,并与肿瘤的发生与转移密切相关。作为PRMTs家族的一个成员,PRMT2充当ERα的共激活因子,以雌激素不依赖的形式与ERα直接结合,并以雌激素依赖方式提高ERα的转录活性。同时在细胞周期调控、炎症反应、肺组织功能、瘦素信号通路及Wnt信号转导等多种生物学过程中,PRMT2均发挥着不可或缺的作用,其在乳腺肿瘤中的作用机理至今仍不清楚。本研究分析了乳腺癌组织芯片中PRMT2蛋白和自噬相关蛋白LC3蛋白、P62蛋白、Beclin1蛋白在不同组织类型和不同分子分型中的表达差异。在此基础上,观察PRMT2过表达对乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞自噬的影响,并探讨可能机制。同时,为了进一步探讨PRMT2新的剪接体PRMT2β与乳腺癌发生发展的关系,采用组织芯片技术分析PRMT2β与乳腺癌临床病理参数的关系,并观察PRMT2β过表达对乳腺癌MCF7细胞增殖、凋亡和自噬的影响,并探讨可能机制。第一部分PRMT2对乳腺癌细胞自噬的影响目的:探讨PRMT2及自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义,观察PRMT2过表达对乳腺癌细胞自噬的影响,并探讨其可能的机制。方法:采用免疫组织化学法,检测组织芯片中159例乳腺癌组织中PRMT2蛋白及自噬相关蛋白LC3B、Beclin1和P62在不同分化和不同分子分型乳腺癌组织中的表达差异。构建PRMT2稳定过表达乳腺癌细胞株,通过透射电镜观察PRMT2稳定过表达对乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231中自噬泡的影响,通过激光共聚焦显微镜观察PRMT2稳定过表达对乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231中LC3免疫荧光的改变,通过Western Blot及WES检测PRMT2稳定过表达对乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231中自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62的改变及随时间的变化,通过激光共聚焦显微镜观察m RFP-EGFP-LC3双荧光在PRMT2稳定过表达后MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中自噬体形成过程。磷酸化抗体芯片检测MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中稳定过表达PRMT2影响细胞自噬的可能信号分子。采用Western Blot检测PRMT2稳定过表达后对MCF-7细胞MDA-MB-231细胞中自噬通路相关蛋白表达。结果:PRMT2和Beclin1蛋白的表达水平在患者年龄、TNM分期、病理分级、淋巴结转移及分子分型等参数中无显著差异（P>0.05）,在组织病理分级Ⅲ级中LC3B高表达组所占例数显著高于LC3B低表达组（P=0.0332）,同时LC3B高表达组在Luminal型乳腺癌中所占例数显著低于LC3B低表达组（P=0.0068）,两组在患者年龄、TNM分期、淋巴结转移等参数中无显著差异（P>0.05）。P62高表达组在淋巴结转移中所占例数显著高于P62低表达组（P<0.0001）,两组在患者年龄、TNM分期、病理分级及分子分型等参数中无显著性差异（P>0.05）。透射电镜观察PRMT2稳定过表达使MCF-7细胞中自噬泡面积缩小,Dox处理12h开始与无Dox处理组相比自噬泡减少,处理24h、48h组自噬泡明显减少。MDA-MB-231细胞中自噬泡面积增加,Dox处理12h开始与无Dox处理组相比自噬泡增加,处理24h、48h组自噬泡明显增加。激光共聚焦显微镜观察PRMT2稳定过表达后MCF7细胞中LC3荧光减少,MDA-MB-231细胞中LC3荧光增加。Western Blot检测PRMT2稳定过表达后MCF7细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3II/I表达量随时间增加逐渐减少,12h、24h、48h组变化较为明显。MDA-MB-231细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3II/I表达量随时间增加逐渐增加,12h、24h、48h组变化较为明显。WES检测PRMT2稳定过表达后MCF7细胞中自噬相关蛋白Beclin1表达量随时间增加逐渐减少,P62表达量随时间增加而逐渐增多。MDA-MB-231细胞中自噬相关蛋白Beclin1表达量随时间增加逐渐增加,而P62蛋白表达量随时间增加而逐渐减少。在MCF7细胞中,PRMT2敲低能上调自噬相关蛋白Beclin1、LC3II/I的蛋白表达水平。通过激光共聚焦显微镜观察m RFP-EGFP-LC3双荧光在PRMT2稳定过表达后MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中自噬体形成过程显示,在MCF7细胞中,PRMT2稳定过表达后,自噬体（黄色斑点）和自噬溶酶体（红色斑点）减少,提示自噬被抑制。而在MDA-MB-231细胞中,PRMT2稳定过表达后,自噬体（黄色斑点）和自噬溶酶体（红色斑点）增多,提示自噬被促进。磷酸化抗体芯片检测结果发现,在MCF7细胞中,PRMT2上调m TOR、P53、Caspase9磷酸化水平,下调AMPK、Akt、GSK3β、NFκB、MAPK、PTEN、STAT1的磷酸化水平。在MDA-MB-231细胞中,PRMT2上调AMPK、GSK3β、NFκB、MAPK、P53、STAT1磷酸化水平,下调Akt、Caspase9、m TOR、MAPK、PTEN的磷酸化水平。Western Blot检测结果显示在MCF7细胞中,诱导PRMT2过表达后,p-m TOR蛋白水平升高,ULK1、p-AMPK、PI3K、PTEN、p-AKT蛋白表达水平下降。在MDA-MB-231细胞中,诱导PRMT2过表达后,p-m TOR、PI3K、PTEN、p-AKT蛋白表达水平下降,ULK1、p-AMPK蛋白表达水平增加。其中,在MCF7和MDA-MB-231细胞中,诱导PRMT2过表达后,p-m TOR、ULK1和p-AMPK蛋白变化趋势相反,而PI3K、PTEN、p-AKT蛋白变化趋势一致。结论:LC3B在组织病理分级Ⅲ级乳腺癌中表达较高,而在Luminal型乳腺癌中表达较低;P62在淋巴结转移的乳腺癌中表达较高。PRMT2过表达抑制MCF7细胞自噬,促进MDA-MB-231细胞自噬。PRMT2通过下调Beclin1信号通路和AMPK-m TOR-ULK1/2信号通路抑制MCF7细胞自噬;PRMT2通过上调Beclin1信号通路和AMPK-m TOR-ULK1/2信号通路促进MDA-MB-231细胞自噬。第二部分乳腺癌组织中PRMT2及其剪接体PRMT2β蛋白的表达及意义目的:探讨PRMT2及其剪接体PRMT2β蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义。方法:采用免疫组织化学方法,检测组织芯片中138例乳腺癌,6例正常乳腺组织和6例良性乳腺组织中PRMT2及PRMT2β蛋白的表达,分析其与临床病理参数的关系。结果:PRMT2β蛋白尽管在不同乳腺组织中表达无显著性差异（P=0.096）,但仍然随着乳腺癌组织类型恶性程度的增加而呈下降的趋势:在正常乳腺组织中阳性率为66.7%,乳腺良性肿瘤中阳性表达率为50.0%,乳腺癌组织中阳性表达率为29.0%恶性肿瘤。相反,PRMT2蛋白表达阳性率从正常乳腺组织到乳腺癌组织逐渐增加:在正常乳腺组织中阳性率为33.3%,在乳腺良性肿瘤中阳性率为83.3%,乳腺癌组织中阳性率占95.7%,统计学分析差异有显著性（P=0.0002）。在乳腺癌组织中PRMT2β的表达与HER2表达呈负相关（P=0.033）,而与雄激素受体（AR）、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、Ki-67、和p53表达无明显的相关性（P>0.05）。乳腺癌组织中PRMT2的表达与PR和HER2显示明显的负相关（分别P=0.039和P=0.019）。结论:PRMT2β蛋白在正常乳腺组织和良性乳腺肿瘤组织中表达较乳腺癌组织中较高。在乳腺癌组织中PRMT2β蛋白的表达与HER2呈负相关。PRMT2蛋白在乳腺癌组织中的表达显著高于正常乳腺组织和良性乳腺肿瘤组织。在乳腺癌组织中PRMT2蛋白的表达与HER2、PR呈负相关。第三部分PRMT2剪接体PRMT2β抑制乳腺癌MCF7细胞生长及自噬目的:探讨PRMT2剪接体PRMT2β对乳腺癌细胞增殖、凋亡及自噬的影响。方法:构建稳定过表达PRMT2β的MCF7细胞系,通过MTT、克隆形成、细胞周期及凋亡分析,探讨PRMT2β在乳腺癌细胞中的作用,通过荧光素酶活性检测和Western Blot技术分析PRMT2β对细胞周期蛋白cyclin D1启动子转录活性及Akt信号通路的影响,通过透射电镜、Western Blot技术探讨PRMT2β对乳腺癌细胞自噬的影响。结果:成功构建PRMT2β-Tet-on稳定过表达乳腺癌细胞系。PRMT2β过表达能明显抑制乳腺癌MCF7细胞增殖和克隆形成,同时诱导细胞周期阻滞和凋亡,抑制乳腺癌MCF7细胞自噬。PRMT2β过表达能抑制乳腺癌MCF7细胞中CCND1启动子转录活性,并通过抑制Akt/GSK-3β信号通路抑制CCND1的表达。结论:PRMT2β抑制乳腺癌MCF7细胞增殖和自噬,诱导细胞周期停滞和凋亡;PRMT2β通过抑制Akt/GSK-3β信号传导通路抑制乳腺癌MCF7细胞中CCND1表达。