目的：　　施旺氏（Schwann）细胞在外周神经的发育与再生中发挥重要作用，但是在严重的神经损伤和变性疾病中Schwann细胞的来源明显不足。Schwann细胞起源于短暂的胚胎神经嵴结构，不过在胎儿甚至成体阶段的多种神经嵴源组织中仍存在迁移后神经嵴源细胞（NCCs），NCCs是潜在的Schwann细胞来源。骨髓是神经嵴源组织之一，虽然骨髓中NCCs的比例很低，但骨髓是容易获取的组织来源。本研究旨在从出生后大鼠骨髓分离应答表皮生长因子/成纤维细胞生长因子2（EGF/FGF2）的骨髓基质细胞（BMSCs）亚群，在此基础上富集成球生长的NCCs，即间充质球（Mesenspheres），并将NCCs定向诱导分化，以获得Schwann样细胞。　　方法：　　1.采用贴壁法从4~6w大鼠分离培养原代骨髓基质细胞（BMSCs），常规传代培养。通过有限稀释法从P2代 BMSCs分离出单细胞克隆亚群，细胞增殖速度最快的亚群作为对照亚群（BMSC-16）。相差显微镜观察细胞形态。　　2.利用NCCs应答表皮生长因子/成纤维细胞生长因子2（EGF/FGF2）并成球生长的特性，通过重复性成球-贴壁两步条件培养法从原代BMSCs分离出BMSCs亚群。可长期传代培养至50代（P50）的亚群作为目标亚群（BMSC-C2）。相差显微镜观察细胞形态。　　3.通过细胞长期增殖曲线、细胞生长曲线、细胞周期流式（FCM）检测、BrdU标记检测，比较目标亚群BMSC-C2与对照亚群BMSC-16的细胞增殖能力。　　4.通过无血清特定条件以克隆细胞密度对BMSC-C2与BMSC-16细胞进行成球培养，比较细胞成球的数目和大小；通过对不同的3代细胞的比较（P53、 P67和P80），分析长期传代对BMSCs成球能力有无影响。　　5.通过传代培养、核增殖抗原（PCNA）的染色、单细胞亚克隆的分离、细胞长期增殖曲线和细胞生长曲线，分析BMSC-C2亚群衍生的Mesenspheres的自我更新能力。　　6.通过波形蛋白（Vimentin）、CD90、CD29、巢蛋白（nestin）、CD133和神经营养因子受体P75（P75NTR）的免疫细胞化学（ICC）染色，CD90、CD73、CD44、CD29、CD133和nestin的FCM检测，分析间充质干细胞（MSCs）和NCCs标志蛋白在BMSC-C2、BMSC-16和Mesenspheres各亚群细胞的表达。　　7.通过荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）检测，比较 MSCs标志（thy1、nt5e、cdh2、vim、cxcr4、cd44、itgb1、dhh、sox2、nes）和NCCs标志（vim、cxcr4、cd44、itgb1、prom1、nes、dhh、 sox10、sox2、msi1、wnt1、snail1、hes1、id2、itga4、hnk1、nfgr）在BMSC-C2、BMSC-16和Mesenspheres各亚群细胞的mRNA水平的表达。　　8.通过特定的条件诱导 Mesenspheres向神经系细胞分化，相差显微镜观察细胞形态，ICC检测神经元标志β-微管蛋白-III（Tuj1）、神经丝蛋白200（NF200）以及胶质细胞标志神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。　　9.通过特定的条件诱导Mesenspheres亚克隆向Schwann细胞分化，相差显微镜观察细胞形态，ICC检测标志蛋白S100β、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、环核苷酸-3磷酸水解酶（CNPase）和P75NTR在诱导的Schwann细胞（iSCs）的表达，通过计数细胞的S100β阳性率进行纯度鉴定和比较。　　10.通过特定的条件诱导 Mesenspheres亚克隆 N1向 Schwann细胞分化， FQ-RT-PCR检测NCCs标志（wnt1、nes、msi1、prom1、hnk1、dhh、cxcr4、sox2、itgb1、id2、hes1、itga4、cd44、 ngfr）和Schwann细胞标志（cad19、cnp、foxo4、gfap、sox10、erbb3、ngfr）在诱导不同时间点（0h、12h、24h、48h）的细胞mRNA水平的表达变化。　　11.通过相差显微镜观察诱导的Schwann细胞(iSCs)与背根节（DRG）神经元在体外共培养过程中的形态变化，ICC检测成髓鞘标志蛋白髓磷脂碱性蛋白（MBP）和髓鞘相关糖蛋白（MAG）的表达，FQ-RT-PCR检测mbp、mag、mpz、egr2、pmp22和 plp1在mRNA水平的表达。　　结果：　　1.从出生后大鼠骨髓分离培养的原代BMSCs贴壁生长，呈现成纤维样细胞形态，并成漩涡状排列。进一步分离获取的应答EGF/FGF2的BMSC亚群（BMSC-C2）和BMSC克隆亚群（BMSC-16）细胞具有相似的形态，BMSC-C2比BMSC-16较小而狭长。　　2. BMSC-C2与BMSC-16亚群相比，具有同样的长期增殖能力；BMSC-C2比BMSC-16具有更快的细胞生长速度。　　3. BMSC-C2亚群与 BMSC-16亚群相比，具有显著的成球能力；且成球能力在长期传代后无明显变化。　　4.从BMSC-C2亚群富集的Mesenspheres可传代培养。从Mesenspheres分离的单细胞亚克隆N1、N3、N4和 N13可不同程度地保持长期传代培养。　　5. BMSCs在蛋白和mRNA水平表达MSCs标志Vimentin（vim）、CD90（thy1）、CD73（nt5e）、CD29（itgb1）、CD44（cd44）和nestin（nes），并在mRNA水平表达cdh2、cxcr4、dhh、sox2和sox10。Mesenspheres在蛋白和mRNA水平表达NCCs标志P75NTR（nfgr）、CD29（itgb1）、CD44（cd44）、Vimentin（vim）、CD133（prom1）和nestin（nes），并在mRNA水平表达dhh、sox2、msi1、wnt1、snail1、hes1、id2、itga4、hnk1和sox10。　　6. Mesenspheres体外定向诱导分化后，具有神经元样细胞或胶质样细胞形态，并表达神经元标志Tuj1、NF200或胶质细胞标志GFAP。　　7. Mesenspheres亚克隆细胞体外定向诱导分化后，呈现梭形Schwann样细胞形态。N1亚克隆细胞分化后，在蛋白水平表达S100β、GFAP、CNPase和P75NTR，且S100β阳性率达到95％以上，显著超过其它亚克隆N3、N4和 N13。　　8. Mesenspheres N1亚克隆细胞向Schwann细胞分化的过程中, iSCs在mRNA水平的表达模式发生变化：Schwann细胞标志（cnp、foxo4、gfap、sox10、erbb3）的表达逐渐上调, NCCs标志（wnt1、nes、msi1、prom1、hnk1、dhh、cxcr4、sox2、itgb1、id2、hes1、itga4、cd44）的表达逐渐下调，但Schwann前体细胞标志cad19的表达仅在诱导的早期（12h）明显上调，而nfgr的表达仍逐渐上调。　　9.将N1细胞分化而来的iSCs与DRG神经元共培养4周后，相差显微镜下观察到竹节样髓鞘形态，并检测到成髓鞘标志蛋白MBP和MAG的免疫荧光共表达，以及mbp、mag、mpz、egr2、pmp22和plp1在mRNA水平的表达。　　结论：　　1.从出生后大鼠骨髓可分离获取应答EGF/FGF2的BMSC-C2亚群，在蛋白和基因水平表达MSCs标志，并具有长期自我更新能力和显著成球能力。　　2.从BMSC-C2亚群可富集Mesenspheres，在蛋白水平表达NCCs标志，并具有一定自我更新能力和向神经系细胞分化的潜能。　　3.从Mesenspheres可分离出单细胞亚克隆，其中N1、N3、N4和N13具有长期自我更新能力，并在基因水平表达NCCs标志。　　4.从Mesenspheres分离出的单细胞亚克隆可被诱导分化为梭形Schwann样细胞，其中N1亚克隆细胞分化而来的iSCs在蛋白和基因水平表达多个Schwann细胞标志，纯度达到95%以上。　　5.从N1亚克隆细胞分化而来的iSCs与DRG神经元共培养，可在体外形成髓鞘样结构，并在蛋白和基因水平表达成髓鞘标志。　　6.从出生后大鼠骨髓可富集迁移后NCCs的Mesnespheres，并且Mesnespheres单细胞亚克隆可衍生出具有体外成髓鞘功能的Schwann样细胞。