产酶溶杆菌OH11菌株摇瓶发酵条件优化和色素突变体筛选、基因克隆及特性的研究

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由真菌、细菌、线虫引起的植物病害的防治一直是农业生产上非常重要的环节。多数病害的防治主要依赖于化学农药,但化学农药的大量使用容易对环境造成污染,危害人畜健康,同时造成病原菌抗性不断上升。而生物防治对环境污染极少,人畜安全,有时对某些有害生物可以达到长期抑制的作用,使用方便,近年来受到了广大的关注。 产酶溶杆菌OHI1菌株是一种新型的生防菌,其分类地位划分在黄单胞科,溶杆菌属。该菌富含G+C,有滑行运动,对由真菌、细菌引起的许多病害都有生防作用,应用前景广阔。为了大规模发酵,降低防治成本,本研究对OHl1的摇瓶发酵条件进行了优化,并对OH11色素突变体进行了研究。 采用单因素试验法对产酶溶杆菌OH11液体发酵的主要影响因子温度、转速等进行了研究,确定了最佳培养条件:温度为30℃、转速为210 rmin-1;通过正交试验以LB为基础培养基对其培养基成分在摇瓶中进行了优化。在优化条件下,发酵培养基中活菌数在72 h时达到8.5×109 CFUml/L,明显高于原基础培养基的结果:72 h时达到1.2×109 CFUml/L;并通过正交试验对摇瓶装量、发酵时间、接种量、初始pH值4种因素进行了优化,优化后的结果为:装液量40 mL/250mL,发酵时间72 h,接种量108 CFU,初始pH值7.5。并且测定了产酶溶杆菌OH11在不同条件下的存活情况。 利用mariner转座子对菌株OH11进行转座诱变,成功构建了OH11的转座子插入文库。通过表型筛选,从2000多株突变株中筛选到一株色素突变株OH11-1。在LB固体和液体培养基中,OHIl-1能产生黑色素。通过亚克隆的方法,我们鉴定了mariner转座子在染色体上的插入位点为hmgA基因。利用自杀载体pEX18GM,通过单交换的方式,构建了hmgA基因的插入失活突变株OHl1-2,菌株OHI1-2在表型上与OHI1-1相一致。通过基因互补,构建了OHI1-2的互补菌株OHI1-3,OHl1-3在表型上恢复了野生型的性状(即在固体和液体LB中不产生黑色素)。利用高效液相色谱技术(HPIC),鉴定了黑色素为尿黑酸,这一结果与序列分析的结果相一致。对色素突变株OHl1-2进行了胞外酶检测,平板抑菌试验和温室试验,结果表明:(1) OHI1-2降低了蛋白酶和葡聚糖酶的分泌,但不改变几丁质酶和纤维素酶的外泌;(2) OH11-2在平板上不改变对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的拮抗活性;(3) OHl1-2降低了对番茄青枯病菌的生防活性。
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