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目的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的主要流行区域是亚洲,我国自1949年于北京分离出第一株JEV而今已累计60余年历史,目前JEV已成为中国流行最为广泛的虫媒病毒之一。世界上第一株西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)于1937年在乌干达境内一名发热妇女的血液中被分离出,此后在全球范围内广泛传播,由WNV感染所引起的西尼罗热(West Nile fever, WNF)已经成为全球最严重的虫媒传染病之一。2014年,吕志等首次在中国新疆喀什地区的尖音库蚊中分离出5株WNV,并在该地区部分发热病人的血清样本中检测到WNV中和抗体,表明中国也存在着WNV的流行风险。JEV和WNV同属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)、乙型脑炎血清群,二者均可通过库蚊等媒介传播,感染后均可引起严重神经系统疾病,二者引起的症状在临床诊断中不容易区分,目前乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)的诊断通常基于JEV抗体检测,由于JEV和WNV抗体存在交叉反应,因此该种方法检测的结果很有可能出现WNV感染的误诊。山东省是JE的高发地区,本研究以2013年山东部分地区临床诊断为JE的病人为研究对象,通过病毒分离、RT-PCR和血清抗体检测的方法,研究该病人中是否存在WNV感染,以及JEV和WNV抗体的交叉反应情况,为JEV和WNV感染的诊断和预防控制提供科学依据。方法1.标本来源山东省济南市传染病医院2013年9～10月入院的242例病人,根据《流行性乙型脑炎诊断标准WS214-2008》临床诊断为JE,共采集急性期血清和脑脊液214份(以入院第一次采集样本为急性期样本,包括177份血清和37份脑脊液),恢复期血清58份,其中30例病人同时有急性期和恢复期血清。病人来自滨州、德州、菏泽、济南、聊城、泰安等地,以济南市为主。2.病毒的分离鉴定使用DMEM培养液(含10%胎牛血清,1%青链霉素混合液)常规培养BHK21细胞,待细胞长成至单层后,取急性期的血清和脑脊液接种,每隔24 h观察细胞病变(CPE),将发生CPE的标本取上清提取RNA,通过巢式RT-PCR扩增JEV和WNV的核酸,扩增阳性者经测序验证后确定是否为JEV或WNV感染；如1w后无CPE出现,使用BHK21细胞继续传3代,每代均提取培养物上清中的RNA进行WNV和JEV核酸的检测。细胞至传3代后,WNV或JEV核酸检测均为阴性的样本,病毒分离定为阴性。对于出现细胞CPE,且JEV或WNVRNA检测证实为阳性的病例,实验室确诊为JEV或WNV感染。3.病毒RNA的检测 对急性期的血清和脑脊液分别提取其中的RNA,使用巢式RT-PCR的方法扩增JEV和WNV的RNA。对于扩增阳性的标本,进行序列测定证实为JEV或WNV感染,并用MEGA5.0软件分析基因序列确定病毒的型别。4.患者血清和脑脊液中抗体的检测运用间接免疫荧光(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)法对单份急性期样本(血清和脑脊液)进行JEV-IgM和WNV-IgM检测；对双份血清样本,急性期和恢复期血清分别进行JEV-IgM和WNV-IgM、JEV-IgG和WNV-IgG检测；对单份恢复期血清进行JEV-IgG和WNV-IgG检测。IFA中,急性期血清中JEV-IgM、WNV-IgM和恢复期血清中JEV-IgG、WNV-IgG均从1：32开始稀释,检测抗体效价；ELISA法从1：100(急性期)或1：41(恢复期)开始进行倍比稀释,检测抗体效价。IFA和ELISA中,均以抗体阳性的最高稀释度作为抗体效价。对于血清学检测结果为下列两种情况的视为WNV感染可疑病例：①两种病毒抗体检测均阳性样本：抗体效价WNV-IgM/JEV-IgM≥4或WNV-IgG/JEV-IgG≥4者。②WNV-IgM (+)、JEV-IgM(-)或WNV-IgG (+)、JEV-IgG (-)的样本。结果1.病毒的分离鉴定 214份急性期血清和脑脊液中均未分离到JEV或WNV。2.病毒RNA的检测巢式RT-PCR扩增结果显示,急性期血清中有4例病人JEV RNA的E片段扩增结果为阳性,经测序证实为JEV RNA, JEV RNA阳性率为1.87%(4/214),未扩增出WNV RNA的3’非编码区的目的片段,MEGA5.0软件的基因序列分析结果表明4例患者感染的JEV均为基因Ⅲ型。3.抗体检测的结果IFA检测结果显示,无论是急性期还是恢复期血清,从1：32开始,随着稀释度的增加,荧光逐渐变弱,未检测到抗体效价WNV-IgM/ JEV-IgM≥4或WNV-IgG/JEV-IgG≥4的标本。ELISA检测结果显示,急性期样本中,WNV-IgM (+)的共74份,有3个样本抗体效价WNV-IgM/JEV-IgM≥4,1个样本WNV-IgM效价为1：800,而JEV-IgM抗体为(-),为高度可疑病例。恢复期样本中,WNV-IgG和JEV-IgG共同(+)的共18例,其中2例抗体效价WNV-IgG/JEV-IgG≥4,另有9个样本JEV-IgG(-)、WNV-IgG(+)。根据WNV-IgM、 WNV-IgG的ELISA效价检测结果,JE患者中WNV感染疑似病例为15例。结论山东省部分地区2013年临床确诊为JE的患者中,JEV RNA检测阳性的患者有4名,其血清中扩增到JEV RNA E区的片段,序列分析证实均为JEV的基因Ⅲ型。根据血清抗体检测结果推测,患者中可能存在WNV感染病例,但由于本次研究因同时具有急性期和恢复期的双份血清样本较少,又无WNV蚀斑减少中和试验(PRNT)对WNV抗体进行进一步验证,故不能完全支持山东省存在WNV流行的情况。结合本次研究结果和山东地区存在WNV传播媒介的情况,提示山东省加强JE防控的同时应增加WNV的监测。