目的:雄激素受体(androgen receptor,AR)是一个通过配体依赖性和配体非依赖性机制激活的转录因子,属于核类固醇受体超家族成员。AR与配体雄激素结合后活化转运入核并结合于靶基因启动子的雄激素反应元件(androgen response elements,AREs)上,诱导一系列靶基因转录从而发挥其生物学作用。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝脏原发性恶性肿瘤,发病在男性占主导,AR是造成这种性别差异的主要因素。在此过程中,AR的转录活性受多种辅调节因子的调控。近年来,越来越多的研究表明转录辅调节因子对AR下游基因表达的调控在肝细胞肝癌的发生发展中起着关键作用。因此,研究AR辅调节因子在AR介导基因转录中的调控机制及其在肝细胞肝癌中的作用具有重要意义。2002年,本课题组以AR-AF1为诱饵,利用酵母双杂交技术分离鉴定出一个新的AR辅激活因子PRPF6。PRPF6是一种mRNA前体的剪接因子,在剪接体的形成过程中起着重要作用。研究表明PRPF6的功能丧失不仅导致mRNA前体的积累,而且导致细胞周期阻滞表型。最近研究发现PRPF6能够促进结肠癌细胞增殖。但到目前为止,对AR辅激活因子PRPF6在肝癌中的研究甚少,PRPF6是否在肝细胞肝癌中参与AR活性的调控,并在肝细胞肝癌的发生发展中起着什么作用至今未见报道。因此,本课题对PRPF6在肝细胞肝癌中的作用进行研究,明确PRPF6是否参与并调控AR介导的基因转录。并以此为切入点深入探讨PRPF6调控AR介导基因转录的作用机制,为肝细胞肝癌的早期诊断和治疗提供一个新的的靶点。研究方法:1.明确PRPF6在临床肝癌组织中的表达情况:首先使用UALCAN数据库分析PRPF6基因在临床肝癌标本中的表达模式及与患者预后的关系;接下来通过免疫组织化学染色检测PRPF6蛋白在肝癌组织及癌旁非癌肝组织中的表达水平。2.确定PRPF6与AR在细胞内是否存在相互作用:利用蛋白质免疫共沉淀实验检测PRPF6与AR在肝细胞肝癌细胞中的相互作用;通过细胞免疫荧光实验检测PRPF6和AR在LM3细胞内是否存在共定位;构建PRPF6的5个截短质粒并检测其与AR相互作用和定位情况。3.明确在肝细胞肝癌细胞内PRPF6是否能够上调AR介导的基因转录:应用双荧光素酶报告基因实验检测PRPF6及其5个截短质粒在LM3细胞中对AR介导的基因转录的调控作用;检测PRPF6对AR两个重要调控区域AF1和AF2介导基因转录的调控作用;通过Real-time PCR实验检测PRPF6沉默对AR靶基因转录水平的调控影响;通过Western blot实验检测PRPF6沉默或过表达对AR靶基因蛋白水平的调控影响;通过染色质免疫共沉淀实验检测ARE区(CCRK启动子)AR招募是否受PRPF6调控。4.探讨肝细胞肝癌中PRPF6调控AR自身的基因转录的机制:Real-time PCR和Western blot实验检测DHT刺激条件下AR的基因和蛋白表达情况;染色质免疫共沉淀实验检测PRPF6是否募集在AR的AREs区及PRPF6对此处AR募集和组蛋白修饰的影响。5.明确PRPF6在肝细胞肝癌细胞中的作用:首先构建PRPF6稳定敲低的LM3和PLC5-AR细胞系,应用MTS和细胞克隆形成实验检测PRPF6对细胞增殖的影响;通过划痕和Transwell实验检测PRPF6对细胞迁移的影响;利用流式细胞术检测PRPF6对细胞周期的影响。6.通过荷瘤小鼠实验检测PRPF6是否在体内影响肝细胞肝癌细胞成瘤及肿瘤生长。结果:1.PRPF6在临床肝癌组织中的表达情况:对UALCAN数据库的分析结果表明,临床肝癌组织中PRPF6的mRNA表达显著高于正常肝组织,并且表达水平随着肿瘤病理分级和临床分级的增加而增加。此外,高水平的PRPF6与较短的总体存活率相关。接下来我们通过免疫组织化学实验检测了PRPF6蛋白在75例临床肝癌组织和33例癌旁非癌肝组织中的表达水平。Hscore评分表明,PRPF6蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁非癌肝组织,并且表达水平随着病理分级的增加而增加。根据免疫组化分析结果,我们进一步分析了高、低PRPF6表达组中PRPF6蛋白表达与HCC临床特征之间的关系。数据显示PRPF6表达与病理分级呈正相关,与其它临床特征无显著相关性。2.PRPF6与AR在HCC细胞内相互作用:CoIP实验结果证明,在LM3或过表达AR的PLC5细胞中,PRPF6与内源性或外源性的AR在缺乏DHT时存在相互作用,DHT刺激后作用增强;在HEK293细胞中过表达AR和PRPF6的不同截短蛋白,结果显示除PRPF6-N截短质粒外,其余均能与AR结合。细胞免疫荧光实验表明在LM3细胞中,在不依赖DHT的情况下内源性AR和PRPF6都定位于细胞核;而在过表达AR和PRPF6不同截短蛋白的HEK293细胞中,在DHT缺乏和存在条件下,PRPF6全长及其截短蛋白PRPF6-N、PRPF6-5TPR、PRPF6-10TPR、PRPF6-15TPR定位于细胞核内,截短蛋白PRPF6-C在胞质和胞核均有定位。而AR主要定位于细胞质中,受DHT刺激后入核与PRPF6全长及其截短蛋白共定位。3.在肝细胞肝癌细胞内PRPF6能够上调AR介导的基因转录:双荧光素酶报告基因实验证明,在LM3细胞中,PRPF6在缺乏雄激素时能够上调AR介导的基因转录,加入雄激素后增强PRPF6对AR介导基因转录的上调作用;而截短蛋白PRPF6-5TPR和PRPF6-10TPR的上调作用减弱,截短蛋白PRPF6-N和PRPF6-C的上调作用消失;AR的配体非依赖区AF1的转录活性受PRPF6调控,而配体依赖区AF2的转录活性不受影响。Real-time PCR实验检测了一些肝细胞肝癌细胞内的AR下游靶基因,结果显示PRPF6敲低后,在DHT缺乏和DHT存在的情况下,AR及其靶基因CCRK和PRC1的mRNA表达水平均下降,而VEGFA和FKBP5的mRNA表达水平没有明显变化。Western blot实验结果显示,在LM3细胞中沉默PRPF6后,AR及其靶基因CCRK的蛋白水平下降,FKBP5的蛋白水平没有变化。在PLC5-AR细胞中得到了相似的结果。而过表达PRPF6后,LM3和PLC5-AR细胞中,AR和CCRK的蛋白水平增加,但在AR表达阴性的PLC5细胞中,CCRK的蛋白水平未有明显变化。ChIP实验证明PRPF6或AR能被招募到AR靶基因的ARE区,并且沉默PRPF6会减少其自身及AR的招募。4.肝细胞肝癌中PRPF6上调AR自身的基因转录的机制:Real-time PCR和Western blot实验结果表明,与对照组相比,DHT的刺激增加了AR基因和蛋白表达水平,提示在肝细胞肝癌细胞中AR基因转录受雄激素的诱导。ChIP实验证明与对照组相比,DHT刺激条件下,AR在AREs区(AR)的招募增加。此外,PRPF6也在此处募集,沉默PRPF6减少了AR的招募及组蛋白H3K36me3的修饰水平。5.沉默PRPF6抑制体外HCC细胞生长:MTS和细胞克隆形成实验证明沉默PRPF6抑制了肝细胞肝癌细胞的增殖。划痕和Transwell实验证明沉默PRPF6对肝细胞肝癌细胞的迁移没有影响。流式细胞术分析细胞周期的实验结果显示,沉默PRPF6明显减少肝细胞肝癌细胞的S期。6.沉默PRPF6抑制体内HCC细胞生长:荷瘤小鼠实验表明,沉默PRPF6的LM3细胞在雄性BALB/c裸鼠皮下形成的肿瘤较对照组小,并且肿瘤的生长速度更慢;免疫组织化学染色实验结果证明,沉默PRPF6的裸鼠皮下成瘤组织中细胞增殖抗原Ki-67的表达水平也相应降低;在小鼠皮下成瘤组织中,PRPF6沉默后,CCRK的蛋白水平也随之减少。结论:1.PRPF6与肝癌的临床分期及患者的预后相关。2.PRPF6促进HCC细胞的S期,促进HCC细胞的生长。3.在HCC细胞中,AR主要定位于细胞核中。PRPF6与AR相互作用,能被招募至AR靶基因的启动子区域,上调AR介导的基因转录。4.在HCC细胞中,PRPF6参与雄激素诱导的AR自身转录上调,增加AR在自身ARE区的招募,催化组蛋白H3K36me3的修饰,促进AR基因的转录,从而进一步地促进PRPF6对AR介导的基因转录的调控作用。