Bcl10转录调控的研究和抗Bcl10~+肿瘤药物的筛选

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Bcl10是一种细胞凋亡调节因子,它位于染色体1P22,这是多个抑癌基因聚集的位置。本研究首先应用免疫组织切片染色和Western blot技术检测了Bcl10蛋白在多种肿瘤组织和三种肿瘤细胞中的表现率。结果发现:在应用Western blot检测三种肿瘤细胞的结果中,宫颈癌HeLa细胞和淋巴瘤CA46细胞都被检测到Bcl10蛋白的阳性反应,但是在293细胞中没有看见。在免疫组织化学染色实验中, Bcl10只是选择性地在特定几种肿瘤组织中出现,特别是MALT淋巴瘤。阳性反应的还有大肠癌、宫颈癌和乳腺癌。而p53蛋白几乎在所检测的样本中都出现了阳性反应,这包括MALT淋巴瘤、大肠癌、宫颈癌、乳腺癌、贲门癌和肝癌。因此我们认为Bcl10和p53不同,它是一个选择性表达的基因。特别是在MALT淋巴瘤中,不同的部位表达的情况也不一样,它和MALT淋巴瘤的形成有很大的关系。我们推测Bcl10表达的组织特异性和它的启动子有关系。为了研究Bcl10基因表达调控的分子机制,我们第一步是从Hela细胞中提取mRNA采用5’-RACE的方法经过反转录和巢式PCR确定Bcl10基因的转录起始点。利用www.genomatix.de中的转录因子扫描程序,分析可能存在的转录因子结合位点,用手工比对的方法剔除分析结果中可能存在的假阳性,筛选可能性比较大的转录因子的区域进行研究。第二步以正常人基因组为模板克隆了Bcl10基因的5’上游序列。在此基础上,制备了不同的重组体,分别连入pEGFPD表达载体和pGL3荧光素酶报告基因表达载体,转染Hela细胞48小时后分别观察绿色荧光蛋白和检测荧光素酶活性,确定Bcl10的启动子的位置。结果显示1)Bcl10基因的转录起始点位于ATG上游的189bp处。2)生物信息学分析发现Bcl10基因的上游调控序列缺少TATA-Box,有七个GC-box,一个CAATbox和多个转录因子的结合位点,包括AP-1等。3)在所制备的6个截短体中,发现在Hela细胞中, P2有比较强的转录活性,位于-477bp~+1bp处,这是启动子的基本转录片段。比P2更长的片段P4(-1893bp~+1bp),有比较低的转录活性,提示该序列可能有负调控元件。在应用生物软件扫描分析Bcl10的启动区时,我们发现在-495bp– -56bp处,存在一个440bp的CpG岛。利用甲基化特异性PCR ( MSP)检测了Bcl10启动子区的甲基化状态。结果在12例MALT淋巴瘤组织中有一例检测出Bcl10基因的异常甲基化。Bcl10启动子区CpG岛过甲基化和MALT癌的发生、发展有关系。最后,我们希望筛选一个对Bcl10敏感的抗Bcl10+肿瘤的药物。利用对Bcl10蛋白有不同反应的Hela细胞和293细胞,作为很好的实验材料,筛选了3种不同比例的壳聚糖铜复合物。结果显示:壳聚糖铜复合物对Hela和293细胞具有很强的抗肿瘤活性。但是,和Hela细胞相比,壳聚糖铜复合物对293细胞更敏感,更有选择性。也就是说,壳聚糖铜复合物抑制293细胞生长的效果更好,尤以CTS–Cu(3 )的抗肿瘤活性最强。我们推测,在Hela细胞中,Bcl10因为突变失去了抑癌功能,而且Bcl10的截短突变体还有利于肿瘤细胞的生长。另外,我们还发现壳聚糖铜复合物俘获S期的293细胞的能力。壳聚糖铜复合物筛选得到的十五肽序列在NCBI的数据库搜索相似序列,发现有一段序列与多药耐药相关蛋白1以及氨基酰-tRNA合成酶的序列同源性很高。
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