研究背景：　　非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）：指除酒精和其他明确的对肝脏有损伤的因素所导致的肝细胞内脂肪过度累积，与机体胰岛素抵抗和遗传易感性有着密切关系，是一种获得性代谢应激性肝脏损伤。乙型肝炎病毒简称乙肝病毒，属于嗜肝DNA病毒科。HBV基因组是部分环状双链DNA，编码四种乙肝病毒蛋白能够翻译成包括蛋白质C、X、P和S四种蛋白质。HBV基因组编码的四种蛋白中，X蛋白质（HBx）是一种多功能调节因子，参与不同的细胞内信号转导途径和调控基因转录的功能，对HBV感染人体肝脏细胞起着重要的作用。现阶段的研究表明，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的患病率之间存在着相关性，但HBV感染造成NAFLD的机制尚不明确。在本课题研究中，发现HBV感染与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生之间存在着重要的联系。本课题研究对HBV感染者和HBV未感染的女性人群中进行统计学分析后，发现在经过年龄校正后，HBV感染者的脂肪肝发病率（16/152，10.5％）与非HBV感染者相比，没有显著差异(OR =0.656;95％CI:0.379,1.134;P=0.131)。大量研究证实HBx蛋白在脂肪肝形成过程中发挥着重要作用，而HBx蛋白是HBV感染人体后的关键调节因子。因而在本课题的研究中，使用含HBx基因的慢病毒质粒pCDH构建HBx蛋白稳定表达的细胞系Huh7-HBx和MIHA-HBx，间接研究HBV感染后对肝细胞的正常生理功能的影响。通过研究发现，HBx转染后细胞相比于对照组细胞，具有较高的氧耗率，ATP合成能力和线粒体膜电位水平，这表明HBx转染后细胞内线粒体功能发生明显改变。HBx转染后的细胞相对于对照组的细胞有着更强的线粒体功能。线粒体除了提供机体运转所需要的ATP外，同时线粒体还是ROS的主要来源。在本研究中也发现HBx转染后细胞ROS水平显著升高。同时伴随着ROS水平升高，细胞内产生了更多和更大的脂滴。这表明线粒体ROS的生成与细胞内的脂滴累积之间存在着一定的关联，ROS可能是调节脂肪酸代谢的信号。当用NAC处理后，HBx转染的细胞内脂滴积聚显著降低并且降低具有时间依赖性。这些结果表明，去除ROS可以减少肝细胞内的脂滴积聚而增加ROS则会诱导脂滴积聚。因此，本研究结果表明，HBV或者说至少是HBx蛋白，并不会降低细胞内脂滴的形成，同时也不是NAFLD的一种保护因素。　　目的：　　1. 为研究HBV病毒与非酒精性脂肪肝发生的关系，本课题首先统计分析HBV感染与脂肪肝的发生率之间的关系。广泛查阅文献表明中国女性饮酒比率较小，因而本课题对大样本的女性体检数据进行统计分析，从流行病学水平分析HBV感染与脂肪肝发病率之间的关系。　　2. 在体外细胞水平上，本课题对 HBV 感染人体后起重要作用的调节蛋白 HBx蛋白进行研究，研究HBx蛋白在肝脏细胞内表达后对肝脏细胞正常生理功能的影响，本课题中将 HBx 蛋白在正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）细胞中进行稳定表达，确定 HBx 蛋白在亚细胞细胞水平上的定位以及表达HBx蛋白后对细胞的增值能力的影响。　　3. 为明确HBx是通过何种机制导致非酒精性脂肪肝的发生，本课题研究了表达HBx蛋白后的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）中线粒体的功能改变。一方面确定HBx蛋白表达后对线粒体氧化磷酸化有哪些具体的影响，另一方面探讨线粒体氧化磷酸化的改变对非酒精性脂肪肝发生的影响。　　4. 为进一步明确线粒体氧化磷酸化与非酒精性脂肪肝发生的关系，本课题对表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）中的ROS水平进行检测，并检测了正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）中的脂滴形成能力。　　5. 为进一步明确线粒体氧化磷酸化通过何种逆向信号分子（ROS, ATP等）的改变逆向调控该信号转导通路蛋白表达，本课题通过NAC处理表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7），检测细胞产生脂滴能力是否有所改变。　　方法：　　1. 2011年10月至2014年3月期间，温州医科大学附属第一医院招募了1882名女性受试者接受全面的健康检查，排除16名慢性HCV感染者。HBsAg阳性被认为是HBV感染，符合四项超声标准（肝脏亮度，深度衰减，肝肾回声对比度和血管模糊）被诊断为脂肪肝。分别通过独立样本t检验，卡方检验，逻辑回归等统计学方法，对1866个女性体检数据进行统计分析。以得出女性体检人群中HBV感染与脂肪肝发病的相关性。　　2. 使用含有HBx基因编码区序列的pCDH载体转染293T细胞产生病毒，收集48h产生的病毒，使用病毒上清感染正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7），通过药物筛选得到能够稳定表达 HBx 蛋白的细胞系。通过 SDS-PAGE 技术检测正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）中HBx蛋白的表达水平，确定HBx蛋白在这两株细胞中已经表达成功。　　3. 通过CCK-8细胞增殖活性检测技术、免疫荧光染色技术分别检测HBx蛋白表达后对正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）增殖能力影响以及明确HBx蛋白在细胞内的定位。　　4. 通过BN-PAGE技术、氧耗能力（OCR）检测技术、ATP生成检测技术、MMP生成检测技术，对表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）线粒体的氧化磷酸化水平进行检测。　　5. 通过ROS生成检测技术对表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）的ROS水平进行检测。　　6. 通过油红O染色技术对正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）表达HBx蛋白后细胞内脂滴生成的能力进行检测。　　7. 通过ROS生成检测技术，油红O染色技术，利用NAC处理表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）细胞，检测细胞内ROS生成能力及脂滴形成能力是否改变。　　结果：　　1. 通过独立样本t检验和卡方检验统计方法发现HBV感染者与HBV未感染者相比有更高的AST、ALT、GGT水平。此外，尽管HBV阳性患者的HDL水平低于HBV阴性受试者，但其他与脂肪肝有关的因素如胆固醇， LDL和甘油三酯未受HBV的显著影响。用逻辑回归统计方法，发现人群中HBV感染降低了脂肪肝的发病率，但经过年龄校正后差异没有统计学意义。　　2. 使用含有HBx蛋白基因的慢病毒载体pCDH产生的病毒上清感染正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7），两株细胞都成功表达了HBx蛋白。　　3. 通过SDS-PAGE技术检测到在正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）中可以稳定表达HBx蛋白，通过免疫荧光染色发现HBx蛋白主要定位于线粒体。　　4. 选取稳定表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）作为后续验证实验的细胞模型，CCK-8 细胞增殖实验发现表达 HBx 蛋白的细胞在体外生长增殖能力降低。　　5. 通过BN-PAGE技术、氧耗能力检测、ATP生成实验及MMP实验对其线粒体氧化磷酸化水平进行检测，发现表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）中线粒体呼吸链超级复合体和呼吸链复合体单体表达水平没有发生明显改变，OCR值上升，ATP生成能力上升，MMP水平增高。　　6. 通过ROS检测技术检测表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）的ROS生成能力，发现与对照组的细胞相比HBx表达的细胞ROS生成明显增加，具有显著性差异。　　7. 本课题用油红O脂滴染色技术检测表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）的脂滴形成能力。结果表明表达 HBx 蛋白后，正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）的脂滴形成能力明显增加。　　8. NAC处理表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）后，发现细胞产生ROS减少。用油红O染色技术检测，发现细胞内脂滴形成减少，且具有时间依赖性。　　结论：　　1. 通过独立样本t检验、卡方检验、逻辑回归等统计方法，发现人群中HBV感染者具有更高的AST、ALT、GGT水平，并且与HBV未感染者相比，降低了脂肪肝的发生率，但经过年龄校正后发现没有统计学差异。此外，尽管HBV阳性患者的HDL水平显著低于HBV阴性受试者，但其他与脂肪肝有关的因素如胆固醇，LDL和甘油三酯未受HBV感染的显著影响。从流行病学上证明了HBV感染与脂肪肝之间存在相关性。　　2. 将HBx蛋白稳定表达于正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）后，其细胞生长增殖能力降低，且HBx蛋白主要定位于线粒体，说明HBx蛋白与脂肪肝发生可能与线粒体相关。　　3. 在表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）中，其线粒体呼吸链超级复合体和线粒体呼吸链单体表达水平没有明显改变，OCR值上升， ATP生成能力上升，MMP水平上升，说明HBx蛋白对于线粒体功能改变起着重要作用。　　4. 通过 ROS 检测技术检测表达 HBx 蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）的ROS生成能力，发现与对照组相比HBx蛋白表达组的细胞线粒体内的ROS生成明显增加，且通过油红O染色技术发现表达HBx蛋白后这两株细胞脂滴形成明显增加。研究结果表明HBx蛋白通过调节线粒体功能产生过多ROS对细胞内脂滴的累积具有重要作用。　　5. 在经过NAC处理表达HBx蛋白的正常肝细胞（MIHA）和肝癌细胞（Huh7）细胞后，线粒体ROS水平降低，同时细胞内脂滴产生也明显减少，且具有时间依赖性。这一结果进一步说明表达 HBx 蛋白后细胞内脂滴形成能力的增加，是由于线粒体OXPHOS水平升高产生过多的ROS导致的。