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为开发出几种具有高活性促钙吸收产品,使食品加工副产品——咸鸭蛋蛋清及蛋壳得到高值化地利用,本文首先通过电渗析法脱盐获取了鸭蛋清,采用不同酶筛选制备高活性促钙吸收鸭蛋蛋清肽;其次以蛋壳为原料制备氯化钙,与鸭蛋蛋清肽制备鸭蛋蛋清肽-钙配合物;再通过超滤分级、氨基酸分析以及液质联用等手段,表征了鸭蛋蛋清肽中重要的促钙吸收活性肽的一级结构;然后对鸭蛋蛋清肽分别进行脱酰胺修饰和磷酸化修饰,体外评价了其促钙吸收能力的提升;最后通过大鼠增加骨密度作用实验,评价了鸭蛋蛋清肽,鸭蛋蛋清肽-钙配合物及磷酸化修饰后鸭蛋蛋清肽的促钙吸收生物学功效,比较了给缺钙者补充肽或补充肽钙螯合物的效果。本文的主要研究结果如下: 1.促钙吸收鸭蛋蛋清肽的制备 经过试验,从5种常用的商用酶中筛选出了本实验用酶——复合蛋白酶(Protamex),用之酶解脱盐咸鸭蛋清,可获取高钙结合活性的鸭蛋蛋清肽。经优化后,最佳酶解条件为:鸭蛋清浓度3%,Protamex加酶量2×104U/g,50℃、pH6.5,酶解3.5h。此时,酶解液可溶性钙结合量为29.22μg/mL,水解度为21.97%。 2.蛋壳氯化钙及鸭蛋蛋清肽-钙配合物的制备 蛋壳氯化钙制备的最优条件为:以蛋壳为原料,浓盐酸体积1.8mL/g蛋壳,固液比为1∶14,35℃下反应30min,其产物氯化钙的纯度可达90.61%,产率达到99.21%。鸭蛋清肽-钙配合物制备的最优条件为:肽钙质量比为2∶1,配体浓度为4%,pH9.0,60℃下反应35min,95%乙醇添加量为反应溶液体积的7倍(v/v)量,在此条件下配合物中钙的质量分数可达8.36%。 蛋壳源氯化钙与鸭蛋蛋清肽配合后,配合物中钙质量分数高于试剂氯化钙与鸭蛋蛋清肽配合物。红外结果显示,鸭蛋蛋清肽中的-COO-参与了配位,其可能与钙以双单齿的形式配位。蛋壳钙源鸭蛋蛋清肽配合物与试剂钙源鸭蛋蛋清肽配合物具有相似的结构。 3.高活性促钙吸收鸭蛋蛋清肽的结构鉴定 经超滤分级后,分子量小于1kDa鸭蛋蛋清肽的钙结合能力最强,对其进行氨基酸分析发现其中酸性氨基酸及Ser、Leu、Phe、Thr、Val和Lys含量较高。利用液质联用技术并结合与质谱数据库比对,从鸭蛋蛋清肽混合物中解析出了8个肽段:VHSS、Q/KMK、ILKN、FEKN、KFT、FQ/KT,该8个肽段中均含较多对钙结合有贡献的氨基酸,其中Lys出现频率最高,其后依次为能被磷酸化的氨基酸(Ser、Thr),及含咪唑基团的His。故该8个肽段均可能为促钙吸收短肽。 4.促钙吸收鸭蛋蛋清肽的修饰 谷氨酰胺酶修饰鸭蛋蛋清肽的最优条件为:pH7.0,温度50℃,底物浓度3%,加酶量5%,时间2.5h。在此条件下修饰后鸭蛋蛋清肽的可溶性钙结合量达到了37.59μg/mL,相比于未修饰肽提升了21.58%。磷酸化修饰鸭蛋蛋清肽的最优条件为:三偏磷酸钠添加量0.2g/g肽,pH9.0,底物浓度3%,温度50℃。在此条件下修饰后所得鸭蛋蛋清肽的可溶性钙结合量为47.12μg/mL,提升值为50.89%,含磷量2.81mg/g肽。 经超滤分级后的两种修饰肽,其钙结合能力均与分子量有关,在分子量小于1kDa时,两者的钙结合能力最强。在四种级份中,磷酸化鸭蛋蛋清肽-钙配合物中钙的质量分数均显著高于相应级份鸭蛋蛋清肽-钙配合物、脱酰胺鸭蛋蛋清肽-钙配合物,磷酸化修饰能较高效提高钙结合能力,且效果优于脱酰胺修饰,并且成本较低。 5.鸭蛋蛋清肽及其钙配合物、磷酸化鸭蛋蛋清肽体内促钙吸收作用研究 动物实验表明鸭蛋蛋清肽和磷酸化鸭蛋蛋清肽均是良好的促钙吸收肽,鸭蛋蛋清肽-钙配合物是良好的补钙制剂。与同剂量的鸭蛋蛋清肽与CaCO3的混合物相比,高剂量磷酸化鸭蛋蛋清肽与CaCO3的混合物能显著增加大鼠钙的表观吸收率、储留率,显著降低其血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性,增加股骨的干重指数、最大载荷和最大应力,股骨和胫骨的骨钙含量、骨密度及骨矿物质含量(P<0.05),并且其与高剂量的CPPs与CaCO3的混合物相比,各指标均无明显差异(P>0.05)。高剂量的鸭蛋蛋清肽-钙配合物与同剂量的鸭蛋蛋清肽与CaCO3的混合物相比,能显著提高大鼠钙的表观吸收率、储留率,股骨钙含量、骨密度、最大应力,以及胫骨钙含量(P<0.05)。表明鸭蛋蛋清肽-钙配合物相比肽与钙的混合物更能增强骨骼组织,提高钙的生物利用率。