本论文以新药发现为核心,开展了两方面的研究:一、丹酚酸A等天然产物对糖代谢的影响；二、匹诺塞林对脑缺血的保护作用。通过对本课题的研究,为新型抗糖尿病及血管性药物的研发提供了实验依据。　　 第一部分黄连碱、丹酚酸A等对糖尿病的防治作用研究　　 糖尿病是一组以胰岛素绝对或相对缺乏为基本病理生理改变,以高血糖为主要临床特征的慢性内分泌代谢性疾病。近年来,其发病率逐年递增,已经成为严重影响人们生活质量和预期寿命的常见病。在糖尿病患者中,90％以上为2型糖尿病。胰岛素抵抗参与了2型糖尿病的发生、发展全过程。因此,降低血糖和改善胰岛素抵抗是防治糖尿病及其并发症的基础。　　 黄连碱是中药黄连的主要化学成分之一,是小檗碱的同系物。已有研究证明,小檗碱具有广谱抗菌活性。目前已经证明小檗碱具有降血糖、调节血脂的药理作用,在临床上,已与其它治疗糖尿病的药物联合应用于治疗糖尿病。但一直未见黄连碱在调节糖代谢方面的药理研究。本实验对黄连碱调节糖代谢方面的作用进行了研究,同时与小檗碱的药效进行了比较。　　 丹酚酸A是传统中药丹参中的水溶性化学成分之一,已有研究证明,丹酚酸A具有多方面的药理活性如:抗氧化、血栓形成抑制、心脑血管损伤保护、抗肝损伤及肝纤维化、抗肿瘤等作用。本课题的前期研究发现丹酚酸A能有效降低糖尿病动物模型的血糖,改善糖尿病合并肾病、肝纤维化病变及糖尿病大血管并发症病变,对糖尿病胰岛素抵抗可能也有改善作用。本实验探讨了丹酚酸A对2型糖尿病胰岛素抵抗的防治作用和作用机制,并同时与黄连碱、小檗碱的作用及作用机制进行了比较,为发现新型的同时具有降糖、治疗糖尿病并发症,改善胰岛素抵抗的药物奠定了实验基础。　　 一、黄连碱对动物糖代谢的影响　　 本课题评价了黄连碱对动物糖代谢的影响。本研究采用ICR小鼠评价了药物对正常动物糖代谢的影响(分正常组,黄连碱-10、30、100 mg/kg3个剂量组及格列本脲-2.5 mg/kg组)。并采用四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠模型,评价了黄连碱对糖尿病动物糖代谢的影响(分模型组,黄连碱5、15、50、150 mg/kg4个剂量组及二甲双胍-200mg/kg组)。结果表明(1)正常ICR小鼠口服给药3天,黄连碱-10 mg/kg剂量明显降低小鼠的禁食血糖,随着给药时间的延长(给药6、10天),黄连碱-10、30 mg/kg剂量表现出显著效果,高剂量未见明显作用；对于非禁食血糖,黄连碱在给药第10天,低剂量才表现出显著降糖效果,且低剂量降糖效果强于中、高剂量。(2)四氧嘧啶糖尿病小鼠实验结果表明,黄连碱可降低小鼠的禁食血糖和非禁食血糖,改善糖耐量,减少小鼠24 h进水/进食量,以黄连碱-50 mg/kg作用效果最好。综合两种动物模型的药效学实验结果,黄连碱具有明确的降糖作用,但降糖作用弱于格列本脲-2.5 mg/kg和二甲双胍-200 mg/kg。　　 二、黄连碱对细胞糖代谢的影响及机制研究　　 在明确黄连碱体内降糖作用后,本实验以人肝癌细胞株HepG2细胞和大鼠骨骼肌成肌L6细胞为研究对象,以小檗碱作为对照,评价了黄连碱对细胞糖代谢和线粒体功能的影响。　　 实验结果表明:(1)黄连碱作用于L6细胞30 min,10-9～10-5 M各浓度均可明显促进细胞葡萄糖摄取:(2)黄连碱10-5、10-4 M与HepG细胞、L6细胞共孵育12 h,细胞对葡萄糖的代谢量可明显增加,其作用随着作用时间的延长而增强,黄连碱10-6M以下浓度随时间延长也表现出促进细胞葡萄糖消耗作用。在10-5、10-4M浓度下,黄连碱对细胞糖代谢的促进率比insulin(3×10-8 M)高,但略低于小檗碱(10-5M)；(3)药物与HepG2细胞孵育,从10 min～24 h不同时间点检测细胞内ATP的含量。结果显示黄连碱10-4M在1-24 h中均可可明显促进HepG2细胞ATP生成,而黄连碱10-9～10-5M则在孵育至24 h时表现出明显作用；小檗碱对细胞ATP生成无明显影响;二甲双胍与细胞孵育24 h可明显提高细胞内ATP含量;与L6细胞孵育,黄连碱10-4 M在6 h时可提高ATP含量,其它浓度均未见明显作用,小檗碱与L6细胞作用1～6h均可明显抑制ATP生成,二甲双胍无明显作用。(4)与HepG2细胞孵育30 min,小檗碱和黄连碱均降低线粒体膜电位；(5)与肝脏/骨骼肌线粒体孵育10 min,黄连碱10-5M可降低肝脏线粒体呼吸链Ⅰ的V3、V4、RCR、OPR,升高ADP/O,同时降低骨骼肌线粒体呼吸链Ⅰ的V3、RCR、OPR;黄连碱对肝脏线粒体呼吸链Ⅱ呼吸功能影响不显著;(6)与肝脏线粒体孵育10 min,黄连碱10-5、10-4 M可促进F0F1-ATPase活性；(7)与肝脏线粒体孵育10 min,在底物刺激下黄连碱可促进线粒体ATP生成,提高ATP含量。　　 综合上述实验结果,黄连碱能促进细胞葡萄糖转运、利用,其体外实验有效浓度在10-6～10-4 M之间,作用强度略低于小檗碱。作用机制研究显示,黄连碱可能通过抑制线粒体呼吸链复合酶Ⅰ的功能,降低线粒体膜电位,而发挥降糖作用,与小檗碱的降糖作用机制类似。但是,黄连碱可通过促进线粒体氧化磷酸化效率,促进ATP生成,进而促进糖代谢,这是不同于小檗碱的作用机制。　　 三、丹酚酸A、黄连碱等改善胰岛素抵抗的作用　　 本研究以自发性2型糖尿病胰岛素抵抗KKay小鼠模型为研究对象,连续给予丹酚酸A(分0.3、1.0、3 mg/kg)、黄连碱-100 mg/kg和小檗碱-100 mg/kg9周,评价这些化合物对小鼠糖尿病模型胰岛素抵抗改善的作用,同时在细胞水平评价了药物对胰岛素协同的作用。　　 实验结果表明:(1)KKay小鼠经过自然病程16周,出现胰岛素抵抗；(2)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱口服给药均可改善口服葡萄糖耐量,丹酚酸A药效强于后两者；(3)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱均改善胰岛素耐量,丹酚酸A效果优于后两者；(4)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱均降低小鼠禁食血糖、餐后血糖、果糖胺和HbAlc,丹酚酸A效果好于后两者；(5)丹酚酸A降低小鼠血浆中TG和LDL,对HDL和CHO无明显影响:黄连碱、小檗碱对小鼠血脂无明显影响。(6)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱均降低小鼠24 h进食/进水量,丹酚酸A作用强于后两者；(7)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱均可降低糖尿病小鼠体重。(8)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱在HepG2细胞/L6细胞上与胰岛素有协同作用,丹酚酸A的效果弱于后两者。本研究结果显示,丹酚酸A可较好地改善KKay小鼠的胰岛素抵抗,黄连碱、小檗碱也有改善小鼠胰岛素抵抗的作用,但是效果低于丹酚酸A;在细胞水平上,黄连碱、小檗碱的作用效果强于丹酚酸A。　　 四、丹酚酸A、黄连碱等改善胰岛素抵抗的机制　　 本部分进一步研究了丹酚酸A、黄连碱、小檗碱改善胰岛素抵抗的作用机制,并进行了药物之间作用机制的对比。　　 实验结果表明:(1)丹酚酸A通过多种机制改善胰岛素抵抗,增加胰岛素敏感性。分别为①调控线粒体功能,表现为促进线粒体复合物Ⅰ、F0F1-ATPase、琥珀酸脱氢酶的活性,促进胰岛素抵抗L6细胞ATP的生成；②改善氧化应激状态,降低胰岛素抵抗L6细胞ROS的生成；③促进PI3K磷酸化,增加GLU4表达及转位,促进葡萄糖转运、利用;④调控AMPK-PGC-1α-Sirt3轴,促进线粒体生物合成,调节机体糖脂代谢;(2)黄连碱可促进线粒体F0F1-ATPase酶活性,促进胰岛素抵抗L6细胞ATP的生成,降低胰岛素抵抗L6细胞ROS的生成；激活AMPK,调节机体糖脂代谢(3)小檗碱可激活AMPK,调节机体糖脂代谢。实验结果提示,丹酚酸A、黄连碱、小檗碱改善IR的作用机制有共同的方面,也有不同之处。　　 第二部分匹诺塞林对脑线粒体呼吸功能的促进作用　　 匹诺塞林是一种广泛存在于蜂胶和植物中的黄酮类天然化合物,具有抗菌、抗炎、抗氧化、神经保护等多种药理作用,本部分对其脑缺血保护作用的机制进行了探讨。　　 本实验利用大鼠全脑缺血模型(4-vessel occlusion,4-VO),评价了匹诺塞林在体内对4-VO大鼠脑线粒体功能的保护作用。结果表明:(1)匹诺塞林降低4-VO全脑缺血大鼠的神经学评分及神经病理分级,减轻神经元损伤；(2)匹诺塞林可明显提高4-VO大鼠脑线粒体的ADP/O比值、V3以及RCI、OPR等参数,保护线粒体结构完整性;(3)体外实验表明,匹诺塞林能显著提高分离的脑线粒体的ADP/O、V3、RCI、OPR,降低V4,保护线粒体结构完整性；(4)匹诺塞林在体外可促进脑线粒体ATP的生成,可促进SH-SY5Y细胞的ATP生成。　　 本研究发现匹诺塞林对脑缺血具有保护作用,其机制可能是通过保护线粒体结构与功能的完整性,降低NADH呼吸链的电子漏流,提高氧化磷酸化效率,促进线粒体呼吸功能,提升线粒体ATP合成能力等实现的。　　 综上所述,黄连碱有降低正常小鼠及四氧嘧啶小鼠血糖的作用,可在细胞水平上促进细胞葡萄糖转运利用,但是效果弱于小檗碱。在改善胰岛素抵抗方面,丹酚酸A改善体内胰岛素抵抗的效果强于黄连碱、小檗碱,但是在细胞水平上,黄连碱、小檗碱的效果却优于丹酚酸A,三者改善胰岛素抵抗的机制相似,但不完全相同。本研究还发现匹诺塞林可通过保护线粒体结构、促进线粒体活性达到保护脑缺血的作用。