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丹参酮ⅡA(TanⅡA)是中药丹参的主要成分之一,具有多种生物活性和抗肿瘤功效,且毒性较低。但其受制于水溶性差,抗肿瘤功效不足等缺陷而难以应用到临床。本文以Tan ⅡA为目标化合物,以抑制肿瘤细胞增殖为指标,在细胞水平筛选出与Tan ⅡA具有协同抗肿瘤作用的天然化合物穿心莲内酯(Andro)和芹菜素(Api)。通过组合物之间的协同作用,增强Tan ⅡA的抗肿瘤活性,为开发天然低毒复方抗肿瘤药物及功能食品提供新的候选药物组合。本文重点进行Tan ⅡA与Andro以及Tan ⅡA与Api两组化合物协同作用机制研究,同时进行体内抗肿瘤功效评价。研究方法、结果与结论如下:(1)与丹参酮ⅡA联用具有协同抗肿瘤作用的中药化合物筛选采用MTT法,以抑制肿瘤细胞增殖为指标,通过筛选实验发现Tan ⅡA与Andro以及Tan ⅡA与Api联合给药对MCF7、BGC823和SMMC7721等肿瘤细胞株的增殖具有协同抑制作用。Tan ⅡA(25 μM)与Andro(100μM)对MCF7细胞的联用指数(CI)为 0.26±0.02;Andro 单用对 MCF7 细胞的 IC50为 183.23 μM,Tan ⅡA 单用对 MCF7 细胞的IC50为51.46 μM;两化合物联用时对MCF7细胞的IC50为Andro 38.45μM和TanⅡA9.61 μM。TanⅡA(25μM)与 Api(50μM)对 BGC823 细胞联用指数 CI 为 0.28±0.01;单用于 BGC823 细胞时,Api 的 IC50为 131.28μM,Tan ⅡA 的 IC50为 61.46μM,两化合物联用时的 IC50 值为 Api 22.30μM 和 Tan ⅡA 11.15 μM。(2)丹参酮ⅡA与穿心莲内酯联用协同抑制人乳腺癌MCF7细胞通过AV-PI双染实验,证实Tan ⅡA与Andro联用对MCF7细胞具有显著协同促凋亡作用。研究发现抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)能够拮抗Andro对MCF7细胞的毒性以及两种化合物的协同作用,但无法拮抗Tan ⅡA对MCF7细胞的毒性,初步探明ROS积累是TanⅡA与Andro联用对MCF7细胞协同作用的关键因素之一。进一步实验发现两种氧化剂L-丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)和砷试剂(DETC)与Tan ⅡA联用均具有协同抗肿瘤效果,并且能够被NAC拮抗,进一步证实ROS是两化合物发挥协同效用的关键因子。利用液相色谱和质谱方法,证实Andro与还原型谷胱甘肽(GSH)类似物NAC能够发生共价结合。采用5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)氧化法测定GSH活性,进一步证实该反应封闭了 GSH上的-SH,在胞内降低了 GSH的还原力。采用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)和二氢乙啶(DHE)染料探针检测细胞内H2O2和超氧化物阴离子水平,结果发现与单独给药比较,TanⅡIA与Andro联用显著提高胞内ROS水平。上述结果证实ROS是Andro与TanⅡA协同抗肿瘤的关键因子。采用蛋白印迹法检测Tan ⅡA和Andro作用后,MCF7细胞内p53及其下游蛋白Bax和PUMA的含量变化。结果显示,Andro与Tan ⅡA联用时,细胞内p53,Bax和PUMA的表达显著提高;使用p53抑制剂Pifithrin-α(Pft-α)预处理MCF7细胞后,TanⅡA与Andro联用对MCF7细胞毒性减低一倍左右,联用指数从0.26±0.02提高到1.18±0.15,两者之间的协同作用消失。说明p53是Andro与TanⅡA协同抗肿瘤的另一关键因子。综上所述,Tan ⅡA与Andro联用于MCF7细胞,p53和ROS信号被显著增强,ROS与p53两个信号通路相互激活是Tan ⅡA与Andro协同抗肿瘤作用的核心机制。(3)丹参酮ⅡA与芹菜素联用协同抑制人胃癌BGC823细胞采用AV-PI双染和蛋白印迹方法,证实TanⅡA与Api联用使细胞内p53表达水平显著上调,胞内Bcl-2/Bax 比值显著降低,细胞凋亡显著增强。研究证实NAC不能够拮抗Api和Tan ⅡA单用及联用对BGC823细胞的毒性。说明ROS不是两化合物对BGC823细胞协同作用的关键因子。采用PI染色法和蛋白印迹实验考察TanⅡA与Api单用和联用,对BGC823细胞周期及胞内细胞周期蛋白(Cyclin)B1和D1含量的影响。结果表明当两种化合物联用时,细胞周期随时间推移依次阻滞在G2/M期(24h),G1及G2/M期(48 h)和S期(72 h),表现出多个细胞检查点上的周期阻滞,且周期阻滞更加严重。细胞周期蛋白含量也随细胞周期发生相应改变。采用圆二色和DNA热变性曲线法研究TanⅡA和Api与DNA的相互作用,结果表明:Api与DNA产生沟槽结合和外部堆积,Tan ⅡA改变DNA骨架的碱基堆积结构。DNA热变性实验发现:Tan ⅡA及Api与DNA结合,热变性曲线发生较大变化,说明Tan ⅡA及Api与DNA结合后对DNA的稳定性产生显著影响。上述实验结果证实TanⅡA以改变DNA碱基堆积的方式与DNA结合,Api与DNA沟槽外部结合,两者共同作用于DNA,加剧细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,是二者产生协同作用的核心机制。S180荷瘤鼠体内实验结果表明:Api(60mg/kg)和TanⅡA(30mg/kg)单用口服无显著的抑瘤效果,联合使用的抑瘤效果显著,抑瘤率为37.6%。两化合物联用抑瘤效果与阳性药物环磷酰胺(30mg/kg)抑瘤效果相当,且毒性低于环磷酰胺(30mg/kg)。综上所述,本研究首次发现TanⅡA与Andro具有显著协同抗肿瘤作用,TanⅡA与Andro分别作用于p53与ROS两个信号通路,两个信号通路相互激活是协同作用产生的核心机制。本研究首次发现Tan ⅡA与Api具有显著协同抗肿瘤作用,TanⅡA与Api分别以改变DNA骨架碱基堆积以及外部沟槽结合方式与DNA结合,加剧细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,是二者产生协同作用的核心机制。