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背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis)是外科常见的急症之一,以起病急骤,病情进展快,并发症多,症状复杂而引起重视。轻症的急性胰腺炎多数为自限性,而重症急性胰腺炎则病情发展迅速,早期即可出现多种并发症。全身并发症较为严重,如全身炎症反应综合征(SIRS)、急性呼吸窘迫综合征、急性肾衰竭、心力衰竭及心率失常、消化道出血、胰性脑病等。常发展为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),病情严重,死亡率高。中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMN)在炎症的发生、发展和转归中起到了重要的作用,是炎症反应的重要组成部分。中性粒细胞凋亡延迟,释放大量炎症因子进一步扩大炎症反应,导致更多的中性粒细胞聚集于炎症区域,最终形成恶性循环,加重炎症对机体的伤害。如果能够及时诱导中性粒细胞凋亡,清除过多的中性粒细胞,能够限制炎症反应,减少组织损伤,促进炎症吸收,有利于机体恢复。线粒体通透性转换孔(mitochrondrial permeability transition pore,MPTP)是位于线粒体内外膜之间由多个蛋白质组成的复合通道。前期实验证明,重症急性胰腺炎患者的外周血中性粒细胞凋亡与生理状态下相比明显延迟。通过体外实验也已经证明,大黄素能够促进中性粒细胞释放细胞色素C,促进中性粒细胞凋亡,有效抑制中性粒细胞的凋亡延迟现象。其中原因可能与大黄素能够诱导中性粒细胞中的Fas和caspase3的表达有关系。但其作用机制和靶点并不十分清楚,有待我们进一步研究。实验目的应用大黄素及地塞米松进行干预,观察重症急性胰腺炎时外周血中性粒细胞的凋亡调控基因表达及凋亡信号传导通路的异常,寻找大黄素作用的具体靶点,探讨在重症急性胰腺炎的病理状态下中性粒细胞线粒体细胞凋亡途径异常的机制,为临床治疗重症急性胰腺炎提供理论依据。实验方法实验一:选择2014年4月至8月的大连医科大学附属第一医院腹部急症一、二科收入的中重度急性胰腺炎患者作为研究对象,取外周血后分离提纯中性粒细胞并等分。以志愿者的外周血作为对照。将SAP组及对照组的外周血中性粒细胞分为对照组(CON组)、大黄素处理组(Emodin组)、地塞米松处理组(Dex组)、大黄素联合地塞米松处理组(Emodin&Dex组)。按照分组给药培养后,使用流式细胞仪检测各组中性粒细胞凋亡的比例,线粒体通透性转换孔检测试剂盒检测各组中性粒细胞线粒体通透性转换孔开放的程度。实验二:选择SD大鼠作为实验对象,随机分为假手术组(SO组)、重症急性胰腺炎模型组(SAP组)、大黄素干预组(Emodin组)、地塞米松干预组(Dex组)、大黄素联合地塞米松干预组(Emodin&Dex组)。假手术组仅剖腹轻轻翻动胰腺。其他组均以逆行注射法向胆胰管中注射1.5%脱氧胆酸钠,以建立大鼠重症急性胰腺炎模型。术后分别按照分组,给予大黄素5mg/100g体重和或地塞米松0.1μmol/100g体重。各组动物术后24h取外周血,分离提纯中性粒细胞。对各组胰腺组织进行病理学检查并评分。检测各组外周血中淀粉酶的含量。流式细胞仪检测各组中性粒细胞凋亡的比例,线粒体通透性转换孔检测试剂盒检测各组中性粒细胞线粒体通透性转换孔开放的程度。Western Blotting检测线粒体通透性转换孔主要组成蛋白VDAC、ANT的表达水平,检测相关凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase3、caspase9的表达水平。实验三:选择SD大鼠作为实验对象,随机分为假手术组(SO组)、重症急性胰腺炎模型组(SAP组)、大黄素干预组(Emodin组)、地塞米松干预组(Dex组)、大黄素联合地塞米松干预组(Emodin&Dex组)。假手术组仅剖腹轻轻翻动胰腺。其他组均以逆行注射法向胆胰管中注射1.5%脱氧胆酸钠,建立大鼠重症急性胰腺炎模型。术后24h取外周血,分离提纯中性粒细胞。对各组外周血中性粒细胞按照分组予以加药培养。另取上述细胞,加入caspase9抑制剂Z-LEHD-FMK培养。流式细胞仪检测各组中性粒细胞凋亡的比例,线粒体通透性转换孔检测试剂盒检测各组中性粒细胞线粒体通透性转换孔开放的程度。Western Blotting检测线粒体通透性转换孔主要组成蛋白VDAC、ANT的表达水平。检测相关凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase3、caspase9的表达水平。实验结果:实验结果一:大黄素对志愿者中性粒细胞凋亡的影响呈剂量效应关系,中性粒细胞凋亡率随着大黄素干预浓度增加而升高。患者组中,对照组与大黄素组中性粒细胞凋亡率比较P<0.05,有统计学意义,说明大黄素对患者中性粒细胞有促进作用。对照组与地塞米松治疗组、大黄素联合地塞米松治疗组的中性粒细胞凋亡率及坏死率比较,P>0.05,无统计学意义,说明地塞米松、大黄素联合地塞米松治疗组疗效不明显。各组的中性粒细胞线粒体通透性转换孔检测,大黄素组平均荧光强度最大,提示其线粒体通透性转换孔开放率高于其他3组。实验结果二:SD大鼠体内实验结果显示,SAP组大鼠病理评分及淀粉酶水平均高于假手术组,P<0.05。其中性粒细胞凋亡率较假手术组明显降低,线粒体通透性转换孔的开放程度也明显降低,P<0.05。Western Blotting结果显示,线粒体通透性转换孔的组成蛋白VDAC、ANT表达水平均有不同程度的下调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平升高,而促凋亡蛋白Bax以及凋亡效应蛋白caspase3、caspase9的表达水平下调,P<0.05。大黄素治疗组的病理评分较SAP组降低,VDAC和ANT等蛋白的表达水平上调,P<0.05。Bcl-2的表达水平下调,而Bax和caspase3、caspase9的表达水平上调,P<0.05。大黄素联合地塞米松治疗组的效果不明显,与SAP组之间的差异无统计学意义。实验结果三:体外实验的结果与体内实验相似。SAP组中性粒细胞凋亡率较假手术组明显降低,线粒体通透性转换孔的开放程度也明显降低,P<0.05。Western Blotting结果显示,caspase9和caspase3在SO组的表达中相对较高,在SAP组中表达水平则较低,其活性条带也相对降低,两者之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。大黄素组中caspase3和caspase9的表达水平以及活性条带的表达水平均有所升高,其与SAP组之间的差异具有统计学意义。Dex治疗组和联合治疗组(Emodin&Dex组)中该两种蛋白的表达则没有明显改变,与SAP组相比差异没有统计学意义(P>0.05)。加入Z-LEHD-FMK后,各组蛋白在SAP组和SO组之间仍存在明显的差异,其差异具有统计学意义(P<0.05)。而在大黄素组中FMK的抑制效果相对明显,与未加FMK组的caspase9活性条带之间表现出明显的差异,具有统计学意义(P<0.05)。结论:大黄素能够对人外周血中性粒细胞的凋亡具有促进作用,在SAP患者中表现的尤为明显。大黄素对中性粒细胞的促凋亡作用与调控线粒体通透性转换孔的活性有关,能够直接或间接的促进线粒体通透性转换孔开放。该促凋亡作用能够增加线粒体通透性转换孔组成蛋白的表达水平,增加线粒体通透性转换孔的开放率,上调相关的促凋亡蛋白的活性,同时下调抗凋亡蛋白的表达水平。大黄素能够直接或间接作用于caspase系统蛋白,促进其水解激活,从而引导下游凋亡程序启动,该作用可被caspase9抑制剂在一定程度上所抑制。大黄素联合地塞米松对SAP的治疗未表现出明显的协同作用。