达氏鳇,俗称鳇鱼。物种起源于距今一亿三千万年的白垩纪,是全世界惟有黑龙江流域才有的珍贵鱼类。作为白垩纪时期保存下来的古生物群之一,曾与恐龙在地球上共同生活过,其原始古朴的外形1亿多年来几乎没有改变,具有珍贵的科研价值。达氏鳇现为国家二级野生保护动物,1998年联合国华盛顿公约将其认定为濒危物种。除此之外,达氏鳇具有很高的经济价值,其鱼卵被称为“黑黄金”,鱼子酱是极其美味。而达氏鳇的生长尤为缓慢,性成熟周期在18年以上,因此探究达氏鳇的繁育生理势在必行。促性腺激素(gonadotropin hormone,GtH)是由脊椎动物脑垂体分泌的促进性腺发育和繁殖的主要内分泌因素。主要包括促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormon,LH)、促甲状腺素(throtroid stimulating horme,TSH)同构成的糖蛋白激素家族。由垂体分泌的促性腺激素的生成和释放受促黄体生成素释放激素(LH-RH)和促卵泡激素释放激素(FSH-RH)直接调控。鱼类的性成熟与促性腺激素的分泌直接相关,因此利用生物学手段,加快开展促性腺激素基因的研究至关重要。本实验对达氏鳇促性腺激素FSHβ亚基和LHβ亚基进行了基因克隆,采用的是反转录法(RT-PCR)和快速cDNA末端扩增法(RACE),并对其cDNA全长的序列进行了生物信息学分析,构建系统进化树以及对其氨基酸进行了同源对比分析。同时,应用实时荧光定量PCR技术,分别对达氏鳇促性腺激素FSHβ亚基和LHβ亚基在十种组织中的表达量进行了分析。此外,将促性腺激素的开放阅读框导入大肠杆菌中进行了原核表达。实验结果如下:(1)设计特异性引物扩增中间片段,并用RACE方法扩增3’端和5’端,最后拼接c DNA全长,LHβ亚基cDNA全长596bp,FSH亚基cDNA全长1090bp,开放阅读框为414bp和387bp,分别编码了137和129个氨基酸。经过Blast比对分析,与其它鲟鳇鱼类相比,其氨基酸相似性均高达98%以上。对蛋白质的二级结构、三级结构、疏水性、跨膜区进行了分析,并构建了系统进化树。构建了系统进化树发现,其与中华鲟亲缘关系较近,与其它硬骨鱼类较远,与哺乳动物中的人和小鼠最远。(2)对达氏鳇脑垂体、脑、肌肉、精巢、卵巢、肝、肾、肠、胃、鳃10个组织进行了荧光定量分析。结果表明,FSH亚基和LH亚基在大多数的组织表达量上具有一致性,脑垂体表达量最高且尤为显著,在精巢和卵巢中有所表达,在脑中有微量的表达,在其他组织中几乎不表达。而两个亚基的差异主要体现于性腺上,FSH亚基在精巢中表达较高,而LH亚基在卵巢中表达量较高。(3)将达氏鳇促性腺激素LHβ亚基和FSHβ亚基的开放阅读框导入Blunt-E1中,再将其质粒提取转入BL21(DE3)里构建成原核表达载体,之后再用IPTG诱导进行蛋白表达,蛋白大小均在14kDa左右。优化其表达条件,结果表明IPTG的浓度对蛋白表达量几乎没有影响,而最优表达条件为:37℃诱导5h。再以此条件进行蛋白大量培养,经过蛋白纯化和western blot鉴定,结果显示出融合蛋白可以与克隆抗体相结合,免疫学活性良好,表明融合蛋白可以在BL21(DE3)中成功表达。