【摘 要】
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纤维素作为一种可以替代化石燃料的可再生能源,在缓解能源紧张和环境污染等方面具有巨大潜力。降解纤维素的传统方法难以实现生物质的高效转化。近些年,一种通过氧化降解纤维素的铜离子依赖酶——多糖单加氧酶（Polysaccharide monooxygenase,PMO）的发现为高效降解纤维素提供了全新的思路,同时由于其可以作为致病性卵菌的毒力因子,为作物保护和粮食安全开辟了机会。本研究以橙色嗜热子囊菌（T
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纤维素作为一种可以替代化石燃料的可再生能源,在缓解能源紧张和环境污染等方面具有巨大潜力。降解纤维素的传统方法难以实现生物质的高效转化。近些年,一种通过氧化降解纤维素的铜离子依赖酶——多糖单加氧酶（Polysaccharide monooxygenase,PMO）的发现为高效降解纤维素提供了全新的思路,同时由于其可以作为致病性卵菌的毒力因子,为作物保护和粮食安全开辟了机会。本研究以橙色嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）AA9家族PMO酶为研究对象,利用TLC、MALDI-TOF-MS、HPLC-RID、定点突变等方法,进行了酶氧化产物的鉴定、氧化方式的确定、底物结合平面上的芳香族氨基酸和活性中心氨基酸对TaPMO酶的影响、TaPMO酶和突变酶与纤维素酶的协同作用。成功从橙色嗜热子囊菌中克隆了目的基因Tapmo,并在毕赤酵母中表达成功得到TaPMO酶。将TaPMO酶与底物磷酸膨胀纤维素（PASC）在50℃、p H5.0条件下反应48h。TLC结果表明产物的生成量与反应时间成正比,反应产物主要是纤维二糖至纤维五糖。MALDI-TOF-MS结果表明,TaPMO酶的氧化产物中不仅存在纤维寡糖,而且还存在着C1氧化和C4氧化的氧化型寡糖。三氟乙酸（TFA）水解反应产物后,使用HPLC-RID结果表明TaPMO酶氧化产物存在C1氧化寡糖;反应产物经Na BH4还原和TFA水解后,使用HPLC-RID结果表明TaPMO酶氧化产物存在C4氧化寡糖。上述结果表明TaPMO酶对底物具有C1和C4氧化的功能。对底物结合平面上的Tyr24、Phe43和Tyr212进行定点突变,以此研究TaPMO酶底物结合平面上的芳香族氨基酸对酶氧化产物和氧化方式的影响。将突变酶与PASC进行反应,TLC结果表明Tyr24、Phe43和Tyr212对酶活性均有不同程度的影响,其中Phe43和Tyr212对酶活性的影响比较大。MALDI-TOF-MS结果表明突变酶反应产物的组成未发生很大变化,Tyr24、Phe43和Tyr212的酶解产物中均含有C1、C4位的氧化。突变酶反应产物经HPLC-RID分析结果显示,Tyr24、Phe43和Tyr212氧化产物中存在C1和C4氧化产物。上述结果表明Tyr24、Phe43和Tyr212的突变对TaPMO酶的氧化方式并未产生明显影响,但是对酶活性产生了明显的影响。将活性中心氨基酸His1、His86和His175进行定点突变后,TLC分析结果显示未检测到任何产物的生成,表明这三个位点是酶活性必需的氨基酸。选取了三种纤维素酶测定TaPMO酶和突变酶与纤维素酶的协同作用。结果显示TaPMO使EG2、CBH、BGL的降解效率分别提高了1.16倍、0.77倍和0.52倍,Y24A对EG2、CBH、BGL的降解效率分别提高了0.35倍、0.20倍、0.17倍,F43A对EG2、CBH、BGL的降解效率分别提高了1.57倍、1.09倍和0.95倍,Y212A与EG2、CBH、BGL的降解效率分别提高了0.13倍、0.10倍、0.13倍。结果表明TaPMO酶和突变酶对不同纤维素酶的降解效率均有不同程度的提高,其中与内切纤维素酶EG2的协同作用尤为突出。同时,与TaPMO酶相比,突变酶F43A对纤维素酶降解效率的提高更为明显,可以初步认为F43A的酶活性高于TaPMO酶。
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