本室前期的研究，已经从双胸蚓组织中提取获得了5种核酸酶样酶，分别命名为EWD1,2,3和EWN1,2。并对这些酶的酶学动力学性质、影响因素、底物特异性等方面进行了研究。根据这些酶的来源、分子量、等电点、层析和电泳等行为以及底物特异性等，初步证明，我们新近发现了双胸蚂组织中存在着多种核酸酶样酶。 为了进一步确证这些新发现的蛋白质的本质和结构，获得其编码基因，本研究应用蛋白质色谱分离纯化技术，PAGE/SDS-PAGE(1-D)、2-DPAGE/2-DSDS-PAGE、蛋白质化学、MALDI-TOF-MS、LC-MS/MS、基因文库、RT-PCR等技术分5个层次对EWD1、EWD2和EWD3进行了研究。 一、高纯度双胸蚓核酸酶的制备：进行蛋白质氨基酸组成和序列的分析需要较大量高纯度(99.5％以上)的酶样品，本研究通过高效液相离子交换色谱层析与1-DPAGE、2-DPAGE电泳分离相结合，采用非变性咪唑—锌反染色法、胶内回收，分别获得了大于99.5％纯度的EWD1、EWD2和EWD3，建立了这些蛋白的可行的高纯度分离纯化方案，得率分别为27.9％(EWD1)、16.7％(EWD2)、16.7％(EWD3)，纯化倍数分别为11.6(EWD1)、11.2(EWD2)、18.6(EWD3)。为进一步的研究提供了样品基础。 二、双胸蚓核酸酶(EWDs)蛋白质表征的研究：采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱法(MALDI-TOF-MS)，进一步鉴定了三种蛋白的纯度，符合分子量和肽质量指纹图谱的测定要求。对3种核酸酶进行分子量测定，结果表明EWD1_3的精确分子量分别为157191.388，69074.741和63461.35。通过酶解样品得到了EWD1和EWD2核酸酶的肽质量指纹图谱，进行Sequest数据库检索，未能发现与之相匹配的蛋白，提示数据库中没有这两种蛋白的信息，推测这两种核酸酶为新蛋白。将3种核酸酶的一般性质与现今发现的核酸酶进行了比较，EWDs较已发现的DnaseⅠ和DnaseΠ分子量大，种类多。该研究进一步给出了分子量的精确数据，通过肽质量指纹图谱和Sequest检索匹配，证明以往未发现同类结构的核酸酶。 三、双胸蚓核酸酶(EWDs)蛋白质一级结构的研究：1.采用质谱和多糖水解酶类初步分析表明，该3种蛋白均为糖蛋白；2.SDS-PAGE、2D-SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS和末端分析对EWDs进行亚基和多肽链数量分析，结果表明，EWD1是由两条多肽链组成的二聚体，分子量分别为61907.322和95284.066，EWD2和EWD3分别由一条多肽链组成。3.通过酸水解法对3种双胸蚓核酸酶进行氨基酸组成分析，结果表明，3种核酸酶的氨基酸组成中，天冬氨酸和天冬酰胺之和的含量最高，都达到近10％，疏水氨基酸亮氨酸的含量也较高，半胱氨酸含量较少，提示其稳定性与蛋白质中疏水氨基酸产生的高比例的疏水键有关，3种蛋白的酸性等电点与多肽链中的酸性氨基酸含量较高有关。氨基酸组成比较显示，该3种酶与其它核酸酶较相似；4.用Edman降解法对经2D-SDS-PAGE进一步分离纯化和转膜的2种双胸蚓核酸酶的N末端序列进行分析，胶内酶切后用串联质谱(LC-MS/MS)对3种核酸酶进行了序列分析，并采用MALDI-TOF-MS法鉴定了3种核酸酶蛋白中的二硫键数目和糖含量。结果显示经Edman降解法测定，EWD1蛋白大亚基的N末端6个氨基酸序列为：D、E、W、V、Y、P，EWD2蛋白的N末端9个氨基酸序列为：L、L、G、P、Y、K、P、K、C；串联质谱的结果对数据库进行搜索，没有有意义的匹配结果，也提示3种核酸酶为新蛋白；MALDI-TOF-MS法显示1号核酸酶中含有8个半胱氨酸，形成4对二硫键，2号核酸酶中有6个半胱氨酸，形成3对二硫键，3号核酸酶中含有2个半胱氨酸，形成1对二硫键。 四、双胸蚓cDNA文库的构建和编码双胸蚓核酸酶的cDNA序列的获得：1.反转录法结合重组DNA技术，构建了双胸蚓的cDNA文库，并随机挑取1000个克隆进行测序，将测序结果用生物信息学的方法转译成随机读码框架，以N末端序列和质谱序列进行了筛库比较，未发现随机挑选测序的560个克隆中含有EWDs的基因序列，但提示了EWDs的表达丰度较低，并给出了蚯蚓表达所需密码子的偏爱性，为进一步的引物设计提供了依据。2.改用简并引物RT-PCR的方法，已获得了编码EWD2的cDNA序列，并对克隆得到的编码序列进行初步的序列分析，结果显示，EWD2由528个氨基酸残基组成，氨基酸组成比例与酸水解法得到的结果基本一致，且其氨基酸序列中存在两段氨基酸序列，经比较显示其与脊椎动物DnaseⅠ的保守序列一致，由序列预测的等电点为4.8，与双向电泳反应的等电点3.9相近，由序列得到的分子量为58263.28，与质谱实测的分子量69074.741相差10811.461，而前面测到其分子中含糖量为15.6％，正好对应于这个差值。 五、双胸蚓核酸酶EWD2蛋白质二级结构的预测：用傅立叶转换红外光谱法测定了EWD2蛋白的二级结构组成，同时应用序列分析软件GOR和SCRATCH对克隆到的2号核酸酶的氨基酸序列进行运算，预测2号核酸酶的二级结构，结果显示有10段氨基酸序列形成α-螺旋的可能性较大。其含量丰富的疏水氨基酸组成特点及其二级结构特征，表明其为一很稳定的蛋白质。 结论1.成功建立了高纯度双胸蚓核酸酶EWD1_3的纯化方法。 2.测定了3种双胸蚓核酸酶蛋白的分子量，EWD1为157191Da，EWD2为69074Da，EWD3为63461Da；得到了肽质量指纹图谱，证明其与已发现的蛋白及核酸酶结构不同。 3.测定了双胸蚓核酸酶样蛋白的氨基酸组成、N末端序列、多肽链数量、二硫键含量、含糖量等一级结构的内容，为进一步进行基因序列研究奠定了基础。串联质谱和与NCBINr数据库对照的生物信息学分析进一步表明发现的蛋白是新蛋白。 4.通过建立双胸蚓的cDNA文库和部分测序，对双胸蚓的基因表达谱及习惯性有了一个初步的了解。进一步通过简并引物PCR获得2号核酸酶样蛋白的cDNA序列，经序列分析得到的氨基酸组成，分子量，等电点等信息与实测值相近，初步证明所克隆的cDNA序列就是编码2号核酸酶样蛋白的序列。为进一步研究蛋白结构和功能提供了基础。 5.用傅立叶转换红外光谱法对EWD2蛋白的二级结构进行了测定，根据由cDNA推出的氨基酸序列对EWD2蛋白的二级结构进行了预测，其含量丰富的疏水氨基酸组成特点及其二级结构特征，表明其为一很稳定的蛋白质，与经实验验证的结果一致。 6.EWD1和EWD3正在进行进一步的cDNA序列和氨基酸序列分析。