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恶性肿瘤治疗过程中化疗产生的耐药现象对肿瘤患者疗效及预后有重要影响。冬凌草是一种具抗肿瘤疗效的天然植物,Jaridon 6是一种从冬凌草中提取分离得到的新型二萜类化合物,前期已经研究并证实其在食管癌细胞中的抗肿瘤机制,但其在耐药细胞中的抗肿瘤活性及其分子机制尚不清楚,故本课题主要通过研究化合物Jaridon 6对胃癌耐药细胞MGC803/5-Fu的抗癌活性及其机制,为新型抗肿瘤化合物的研究提供新的思路和方向。首先,我们研究了化合物Jaridon 6通过Akt通路对耐药细胞MGC803/5-Fu增殖的影响。采用MTT法与细胞平板克隆形成实验检测化合物Jaridon 6对耐药细胞MGC803/5-Fu的增殖的影响;DAPI染色与Annexin V/PI双染色法观察化合物Jaridon 6作用MGC803/5-Fu后对细胞凋亡的影响;同时,Annexin V/PI染色法检测Jaridon 6对MGC803/5-Fu细胞周期的影响;Western blot实验检测p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-7、PARP-1等蛋白表达量的情况。结果显示,化合物Jaridon 6对耐药细胞MGC803/5-Fu具有较好的增殖抑制作用,且能够抑制MGC803/5-Fu细胞集落的形成;DAPI染色后在显微镜下观察到MGC803/5-Fu细胞的形态变圆,细胞核皱缩;Annexin V/PI双染色法检测到化合物Jaridon 6促进细胞MGC803/5-Fu早期凋亡;同时将MGC803/5-Fu细胞阻滞在G0/G1期;Western blot实验表明Jaridon 6可以降低MGC803/5-Fu细胞内p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β的蛋白表达量,PI3K、Akt、GSK-3β蛋白表达量无明显变化,同时增加cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-7、cleaved-PARP-1蛋白表达水平,激活了细胞内Caspase途径,促进细胞凋亡。接着我们研究了化合物Jaridon 6对MGC803/5-Fu细胞自噬的作用。细胞水平用免疫荧光技术检测自噬标志性蛋白LC3B在MGC803/5-Fu细胞内的自噬发生程度和定位情况,透射电子显微镜观察化合物Jaridon 6作用于MGC803/5-Fu后细胞内自噬体的超微结构;蛋白水平用Western blot方法检测蛋白LC3B-Ⅱ、p62的表达,又通过加自噬抑制剂3-MA进一步检测LC3B-Ⅱ、p62蛋白的表达情况。结果表明,化合物Jaridon 6作用于MGC803/5-Fu后,免疫荧光法观察到LC3B主要定位于细胞质中,且荧光强度随着化合物浓度加大而增加;透射电镜可以观察到细胞质内由双层膜或者多层膜包裹的自噬体结构和由单层膜包裹的自噬溶酶体结构;Western blot实验检测到化合物Jaridon 6可以上调MGC803/5-Fu细胞内蛋白LC3B-Ⅱ的表达,下调p62蛋白的表达;加自噬抑制剂3-MA后,与阴性对照组相比,蛋白LC3B-Ⅱ下调,化合物和3-MA联用组蛋白LC3B-Ⅱ表达增加,且比单用化合物组稍微降低,但化合物和3-MA联用组蛋白p62比阴性对照组降低,比单用化合物组增加。最后我们对化合物Jaridon 6作用MGC803/5-Fu后细胞转移的影响及其发生机制进行了探索。细胞水平用划痕实验和Transwell实验观察化合物Jaridon 6对耐药细胞MGC803/5-Fu转移的影响;蛋白水平用Western blot方法检测了标志蛋白E-cadherin、ZO-1、β-Catenin、N-cadherin、Vimentin,转录因子Snail、Slug等蛋白的表达量。结果发现,细胞划痕实验和Transwell实验均表明化合物Jaridon6能够抑制细胞MGC803/5-Fu的转移;Western blot方法检测到E-cadherin、ZO-1蛋白表达量增加,N-cadherin、Vimentin蛋白表达量降低,细胞浆中β-Catenin增加而细胞核内β-Catenin降低,Snail、Slug蛋白表达量也是降低的。综上所述,本课题主要研究了新型二萜类化合物Jaridon 6作用胃癌耐药细胞MGC803/5-Fu后对PI3K/Akt通路、细胞自噬、细胞转移的影响及其机制。主要创新点有:1.提出并证明了Jaridon 6通过PI3K/Akt通路,激活Caspase途径,促进耐药细胞MGC803/5-Fu的凋亡;2.Jaridon 6可以诱导MGC803/5-Fu细胞自噬的发生;3.Jaridon 6通过抑制EMT发生发展影响MGC803/5-Fu的细胞转移过程。本研究阐明了Jaridon 6的抗肿瘤作用机制,为其他新型抗肿瘤耐药化合物的发现奠定了基础。