论文部分内容阅读
腺苷酸环化酶3(AC3)基因突变引起的肥胖,是迄今为止发现的第一个单基因肥胖疾病。尽管大量的基因组关联分析数据证明,人类AC3上存在多个与肥胖相关的SNP,但这些SNP位点是否对AC3的表达及功能有所贡献尚未探明。CRISPR/Cas9技术可以进行单碱基编辑,因此本文在对人类AC3基因肥胖相关SNP位点进行生物信息学分析的基础上,以293T细胞为主要实验材料,利用CRISPR/Cas9技术对AC3基因上肥胖相关SNP位点进行编辑,探究SNP位点对AC3基因表达的影响及其机制:1、对人类AC3基因肥胖相关SNP位点进行生物信息学分析:1)对蛋白的翻译后修饰位点以及3’UTR上miRNA结合位点进行预测分析,发现仅在exon1和exon17上的SNP位点可能发生磷酸化,且3’UTR上的SNP位点无miRNA结合;2)预测基因上SNP位点的转录因子结合情况,发现可能与EMX家族,OTX家族,KLF家族等转录因子结合,为研究SNP调控AC3表达的机制奠定基础。2、为研究exon13 SNP(rs2289092),exon17 SNP(rs1127568),3’UTR SNP(rs1044040)和intron1 SNP(rs6545814)等位点对AC3表达的影响:1)首先对SNP位点所在序列进行敲除,探究SNP位点所在序列在AC3表达中的作用。通过构建分别靶向以上四个SNP位点所在序列的Cas9-sgRNA质粒,转染至293T细胞中,根据靶序列产生的indels(%),筛选最佳gRNA。利用最佳gRNA对靶序列进行敲除后检测AC3的表达量,发现敲除exon13或exon17 SNP位点靶序列后AC3表达量降低;2)为进一步明确SNP位点单个碱基突变对AC3表达的影响,通过构建同源重组质粒:Cas9(D10A)-sgRNA质粒和含exon13-SNP位点同源臂的Donor-HR质粒,转染至293T细胞,构建点突变exon13SNP的稳转细胞系,检测AC3的表达情况,结果显示点突变后AC3表达量几乎不发生改变。3、为初步探究转录因子与SNP位点的差异性结合调控AC3表达的机制,本实验构建了含有野生型exon13或点突变exon13的双荧光素酶报告质粒,分别与转录因子EMX2和OTX1共转染至293T细胞,48 h后利用报告基因检测系统检测荧光素信号,以探究转录因子EMX2和OTX1与exon13-SNP位点的结合情况,结果显示EMX2与碱基为T的序列的结合力强于G,OTX1与碱基为T的序列结合,与碱基为G的序列几乎没有结合。随后将EMX2和OTX1分别与野生鼠源AC3和exon13 SNP点突变鼠源AC3共转染至293T细胞,发现与EMX2共转染后野生鼠源AC3表达量显著降低,为在小鼠活体验证EMX2调控AC3表达奠定基础。结论:1、经生物信息学分析,仅在AC3基因exon1和exon17的SNP位点处可能发生磷酸化修饰;AC3基因肥胖相关SNP位点可能与EMX家族,OTX家族,KLF家族等转录因子结合。2、AC3基因exon13上的SNP位点突变后对AC3的表达没有影响。3、转录因子EMX2可能通过与exon13 SNP位点的序列依赖性结合,进而调控AC3表达。