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目的 调查河北省结核分枝杆菌二线抗结核药物耐药表型及耐药相关基因突变分布特征,分析耐二线抗结核药物菌株基因分型特点,探讨耐二线抗结核药物菌株表型、耐药相关基因突变及基因分型三者之间的关系,为了解结核病的流行趋势、制定预防控制措施、快速诊断耐药结核病、优化抗结核治疗方案等提供科学依据。方法 对2014年1~12月在河北省收集的316株耐药结核分枝杆菌(指至少对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素中的一种抗结核药物耐药)和100株泛敏感结核分枝杆菌进行传代复苏,将成功复苏的菌株通过比例法罗氏固体药敏试验对氟喹诺酮类药物(氧氟沙星、左氧氟沙星)和二线注射类药物(卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星)等共5种二线抗结核药物进行药物敏感性试验检测。运用一代DNA测序技术对二线抗结核药物耐药相关基因gyrA、gyrB、rrs、eis启动子区、tlyA进行序列分析。采用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术和分枝杆菌散在重复单位-数目可变串联重复序列(Mycobacterial interspersed repetitive units-variable number tandem repeats,MIRU-VNTR)技术对二线耐药菌株进行基因分型。结果 1本研究共纳入416株结核分枝杆菌,其中有80株因受到污染或未成功复苏而被排除在本研究外,最终共有336株被纳入到本研究中,包括257株耐药菌株和79株泛敏感菌株。2在257株耐药菌株中,对五种二线抗结核药物均敏感和耐药的菌株所占比例分别为51.75%和1.56%。此外,氧氟沙星、左氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素的任意耐药率分别为32.68%、21.79%、20.23%、7.00%和6.23%。3河北省初、复治结核病患者中氟喹诺酮类药物的耐药率分别为22.76%和45.54%。4 97株耐氟喹诺酮类药物菌株中,84.54%的菌株发生gyrA基因突变,7.22%的菌株存在gyrB基因突变,另外,共检测到3株gyrA和gyrB双重突变。5 63株耐二线注射类药物菌株中,rrs、eis启动子区及tlyA的突变频率分别为38.10%、7.94%和4.86%。6与药敏试验结果比较,gyrA和gyrB联合检测诊断氟喹诺酮类药物表型耐药的灵敏度和特异度分别为79.38%和89.38%;rrs、eis启动子区和tlyA联合检测诊断二线注射药物表型耐药的灵敏度和特异度分别为50.79%和97.42%。7通过比较北京基因型菌株和非北京基因型菌株之间五种二线抗结核药物的耐药率发现,差异均无统计学意义(P>0.05)。另外,北京基因型菌株和非北京基因型菌株之间五种抗结核药物耐药相关基因突变频率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。8在124株耐二线抗结核药物菌株中,发现共形成113个基因型,包括107个唯一型基因型和6个簇群,每个簇群中含有2~4株菌株,成簇率和近期传播率分别为13.71%和4.84%。所有成簇菌株均为北京基因型。结论 1河北省五种二线抗结核药物耐药率由高到低分别为氧氟沙星>左氧氟沙星>卡那霉素>阿米卡星>卷曲霉素,其中两种氟喹诺酮类药物之间以及三种二线注射药物之间均表现出交叉耐药,但程度并不相同。因此,有必要进行二线药敏试验,以便制定科学有效的治疗方案。2河北省复治结核病患者中氟喹诺酮类药物的耐药率较高,应加强复治患者中氟喹诺酮类药物的耐药监测,以避免复治患者进一步发展成为广泛耐药结核病。3 gyrA基因在第89~94位点发生突变是本地区氟喹诺酮类药物产生耐药的主要机制;gyrA和gyrB双重突变能作为氟喹诺酮类药物耐药表型检测的特异性突变。4 rrs A1401G突变对于二线注射药物耐药表型的快速分子诊断具有一定的参考价值。5河北省二线抗结核药物耐药菌株的传播主要是由于内源性复燃所致,但存在一定比例的近期传播,主要表现为小规模散发成簇。图5幅;表14个;参125篇。