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尿卟啉原Ⅲ甲基化酶(Uroporphyrinogen methyltransferase, UPMT)是维生素B12的分支合成关键酶,也是一种新型荧光蛋白。但是,和绿色荧光蛋白相比,它的应用研究报道较少。本文以玉米UPMT作为筛选标记,分别研究了基因插入和融合表达对重组大肠杆菌菌落红色荧光的影响,取得如下结果：1.分析了玉米UPMT编码基因cobA在大肠杆菌不同启动子下的本底表达。结果表明：cobA基因在Lac, T5, Trc和Tac启动子下均有本底表达,转化菌斑呈红色；但是,它在T7和araBAD启动子下无本底表达。2.分析了玉米UPMT编码基因cobA在Lac启动子下不同菌株的表达水平。结果表明：DH5a、JM109、XL-Bluel和TG1菌株形成的菌斑,长紫外灯下菌落荧光没有明显差异。3.构建了基于玉米UPMT插入失活的大肠杆菌T载体,分析了不同长度片段的插入效果和插入一个500 bp片段的克隆效率。结果表明：250 bp,370 bp,420 bp,1000bp和1800 bp不同长度片段均能装入该T载体。该T载体中插入TCA三核苷酸,编码一个Ser残基(为T载体中-TXA-编码分子量最小的氨基酸残基),导致重组菌落红色荧光消失。凝胶电泳检测结果表明,500 bp插入的克隆效率为92%,和传统的基于a肽插入失活的T载体克隆效率相似。4.初步分析了插入失活的机制。在T载体中插入一个Ser残基的突变体导致UPMT蛋白突变体表达为包涵体,表明插入区域参与重组蛋白的折叠。5.利用定点突变构建3个麦芽糖结合蛋白(MBP)的突变体,即折叠缺陷型(G32D)、两种包涵体类型(分别为A264D和G32D/I33P)。它们的的C端分别融合表达α肽,电泳分析结果表明：A264D,G32D/I33P两个突变体蛋白均在沉淀中表达,而折叠缺陷型G32D突变体蛋白在上清和沉淀中都有表达。6.利用野生型和突变体MBP的C端α肽所具有的β-半乳糖苷酶活性,检测蛋白的折叠和水溶性。结果表明,两者呈高度正相关。7.用UPMT分别取代野生型和突变体MBP的C端α肽。荧光分析结果表明：它与MBP的折叠和水溶性呈现正相关,和α肽活性检测的结果一致。综上所述,玉米UPMT作为筛选标记,在构建大肠杆菌克隆使用T载体中具有很高的灵敏度,1个氨基酸的插入导致重组菌落荧光的消失。作为筛选标记,它还可以灵敏地指示上游蛋白的水溶性和折叠水平,这为快速筛选大肠杆菌异源蛋白的表达水平奠定基础。