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目的 辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶(NADP-dependent retinol dehydrogenase／reductase，NRDR)是黄东阳等于1997年在兔肝细胞中发现并纯化的一种新的催化视黄醇氧化／还原反应的脱氢酶，其参与维甲酸在体内的第一步代谢反应。NRDR对视黄醇有很高的底物特异性与亲和性，酶活性也远大于迄今所报道的乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)与细胞微粒体短链乙醇脱氢／还原酶(short-chain aliohol dehydrogenase／reductase，SCAD)类，其活性在其它哺乳动物肝中也普遍存在，但以兔肝脏为最高。兔与小鼠的NRDR cDNA相近，全长约为1200bp，人的NRDR cDNA全长约为1300bp，三者编码区均为783bp，均编码260个氨基酸，已相继被克隆登录GenBank[AB045133][BC003484][AB045131)，但尚未有论文发表。本研究通过鉴定人肝组织中NRDR不同剪接体(NRDRiso)全长cDNA，分析其核苷酸序列与氨基酸序列的结构特征，并进行RT-PCR表达分析，以证实人肝组织中新的NRDR不同剪接体的存在，为今后进一步研究体内维甲酸的代谢情况奠定基础。 方法 1．总RNA提取、纯度鉴定及cDNA合成： 人、小鼠肝脏总RNA提取按QIAGEN公司RNeasy Mini Kit操作完成。cDNA合成按Ominiscript Reverse Transcription Kit进行。 2．NRDR cDNA片段的扩增 根据人、小鼠NRDR编码区的一致性序列，设计一对引物，分别扩增人与小鼠肝脏CDNA片段。结果，小鼠PCR产物为约630hp的单一条带，而人的扩增产物是两条分别为630hp及400hp左右的条带。测序结果，小鼠PCR产物为635hp，人PCR产物分别为635hp 与377hp。人的377hp 片段的前29fop 与人635hp 的前 291hp序列完全相同，二者后 86hp序列也完全相同，即 377hp片段与ossnp片段相比，中间缺失了iss hp。 3．RACE法从人肝脏中扩增全长CDNA 3．13’RACE： 采用 TaKaRa公司（大连乃’RACE试剂盒。首先，以试剂盒提供的 Oligo dT－3 sites Adaptor primer进行逆转录；然后，以两条序列共同的 29 hp部分为模板，设计 F引物J引物为试剂盒提供的 3 sites Adaptor primer，进行 PCR反应。 3．2 5’RACE： 采用 TaKaRa公司（大连广’RACE试剂盒。首先，以两条序列中缺失的258hP部分为模板，设计5’磷酸化RT引物进行逆转录；然后降解杂交 RNA；接着进行连接反应，使 CDNA环化或形成串联体；最后进行PCR反应，采用巢式PCR，设计两对引物；另外，以377hp和635hp片段缺失部交界区为模板设计5’磷酸化RT引物进行逆转录，再采用巢式PCR，设计两对引物，进行5’RACEPCR。 4．RT－PCR分析： 用TriZOI提取人胚胎及成人多种组织的总RNA，根据人＊鼠NRDR编码区一致性序列设计的引物进行RT－PCR反应。 结 果 1．3’j’末端和全长CDNA序列获得 用 3’RACE方法得到两条分别长为 921hP（NRDR 3’末端）和 ·2·663hP（NRDfuSO 3’末端）的片段。采用 5’RACE方法获得了两条长为 317hp（NRDR 5’末端）和 315hp（NRDmS。5’末端）的片段。 综合上述人肝脏 RT一PCR3’RACE与 5’RACE法扩增所得序列，得到了两个全长 cDNA，一个为 1261 hp的 NRDR，另一个为1003 hp的NRDR新亚型。 2．重组基因片段序列分析结果： 2．ICDNA序列分析： 2．1．互 基因名称确定： 经Blastn比较得知全长为 1261hP的cDNA与 GenBank登录的人过氧化物酶体的短链乙醇脱氢酶cDNAhe］isomd s讪rt－chain alcohol dehydrogenase，SCAD一 SRL，1258hp，BC003019）几乎完全一致；与最初所报人NRDR的 1325hp CDNA（AB04513）相比，编码区完全一致；而1003hp CDNA为一新的亚型序列，与 126fopCDNA相比在编码区缺少连续的258hp序列，其它完全一致，因此，我们将 1003hp CDNA以 NADP－dePelldent比tinol·dehydrogell－ase／nductase short isoform（NRDoso）登录 GenBank数据库（AY07 856）。 2．1．2 ORF’分析： 将全长为 1003hP 的NRDRISO CDNA联网到NCBI的 ORFinder服务器进行ORF分析，确认该cDNA序列起始密码位于60hP处，终止密码位于 584hP 处，由 525hP 的读码框、419hP的 3’端非翻译区和59hP的5’端非翻译区组成，编码174个氨基酸。其聚腺着酸化信号AATAAA位于终止密码子下游372hP处，POlyA位于986hp 处。 2．2 基因组结构分析： 人NRDR的基因位于14号染色体长臂，整个基因序列为52638 hp，含有8个外显子和7个内含子。NRDRISO是由8个外显子中的1在3＊S外显子选择性剪接而成。 ·3· 3．推测的蛋白质序列分析： 3．1 基本性质分析： NRDfuSO基因编码的174个氨基酸中含有SCAD家族保守模·序TGXXXGXG，等电点为5．24，分子量为18．6Kda。Blast分析表明，人NRDffiSO与人SCAD－Sffe的前后氨基酸序列完全一致，只不过中?