论文部分内容阅读
毛竹叶中含有大量具有生物活性的黄酮碳苷,C-糖基转移酶(C-glycosyltransferase,CGT)是黄酮碳苷生物合成代谢途径中C-糖基化的关键酶。目前,还没有关于毛竹叶黄酮碳苷的C-糖基化途径及其CGT的报道。本研究从毛竹叶中通过提取、硫酸铵分层沉淀、透析、葡聚糖凝胶过滤、阴离子交换层析、超滤脱盐等方法分离纯化CGT,并对以上分离纯化过程进行优化。分别选择圣草素查尔酮、圣草素、木犀草素作为底物,根据已建立的CGT催化的C-糖基化反应体系,进行可能的C-糖基化途径验证。运用数据库搜索比对和Q-TOF检测分析等方法手段,找出毛竹CGT的基因序列和一级结构氨基酸序列。取得如下结果:1.实验以CGT反应体系中产物和底物的主要黄酮(荭草苷、异荭草苷、圣草素查尔酮、圣草素、木犀草素)为目标,以相应的标准品为对照,建立了高效液相色谱检测方法:Water XTerra?MS C18 5μm(250 mm×4.6 mm)色谱柱;流动相为乙腈、5‰乙酸/水缓冲液,梯度洗脱。从精密度、稳定性和回收率对该方法进行评价。毛竹叶黄酮碳苷CGT反应体系的建立:通过研究缓冲盐p H,反应温度,反应时间,底物(糖基受体)浓度和缓冲盐浓度对CGT活性的影响,建立毛竹叶黄酮碳苷C-糖基化反应体系。该反应体系总体积为880μL,其中0.1μmol/L的Tris-HCl缓冲液为480μL,粗酶溶液160μL,31.76μmol/L底物(糖基受体)溶液和448μmol/L UDP-葡萄糖(糖基供体)溶液共240μL。CGT催化反应体系温度为在28oC,反应时间为40 min,加入40μL纯乙酸终止反应。毛竹叶黄酮碳苷CGT的提取分离纯化方法优化:毛竹叶CGT最佳提取条件是:提取缓冲盐应选择Tris-HCl缓冲盐,最佳提取p H是8.1,料液比在1:3,提取时间在3 h。确定收集硫酸铵饱和度在30%~80%的沉淀。葡聚糖凝胶的洗脱液应该选择Tris-HCl(含5 mmol/L DTT)缓冲液。将经阴离子交换层析纯化后的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,结果表明,在凝胶上约50 k Da处有一条明显的蛋白带,说明CGT纯度较高和分子量大约为50 k Da。同时该结果也说明以上纯化步骤可行,可以达到很好的纯化效果。2.毛竹叶黄酮碳苷C-糖基化途径的研究:分别选择圣草素查尔酮、圣草素、木犀草素三种可能的底物(糖基受体)建立三个反应体系。检测三个反应体系中底物的减少量以及合成产物异荭草苷或异荭草苷的增加量分析毛竹叶黄酮碳苷生物合成过程中可能的C-糖基化途径。结果表明,毛竹叶黄酮碳苷C-糖基化的主要途径是CGT催化木犀草素和UDP-葡萄糖直接合成异荭草苷,次要途径是CGT催化圣草素查尔酮和UDP-葡萄糖,或圣草素和UDP-葡萄糖间接合成异荭草苷。毛竹叶CGT极易催化生成C-6黄酮碳苷(异荭草苷),而极少催化生成C-8黄酮碳苷(荭草苷)。3.毛竹叶黄酮碳苷CGT的质谱及结构分析:将SDS-PAGE纯化后的CGT回收,并经胰蛋白酶酶解处理后,进行HPLC-Q-TOF-MS/MS检测分析。根据蛋白质质谱裂解规律,解析出四个CGT肽段,四个肽段的氨基酸序列分别是:PSSSD,DQLSELAAGLEASGCR,GTVVDR,DDDR。四个毛竹CGT肽段的氨基酸序列均可与毛竹基因(PH01000603G0510)编码的蛋白质氨基酸序列匹配。将毛竹基因(PH01000603G0510)的碱基序列与水稻的CGT基因的碱基序列进行比对,两个基因的匹配率为81%,可以初步认定该毛竹基因序列(PH01000603G510)可能是毛竹CGT基因序列。本文主要从毛竹叶中分离纯化CGT,研究了毛竹叶黄酮碳苷的C-糖基化途径以及CGT的酶学性质和一级结构氨基酸序列特征,为深入研究毛竹叶中的CGT奠定良好的基础。