线粒体基因组作为细胞核外的一种遗传系统，具有完整性、多态性、自主性和小型性等独特的优点。对线粒体基因组的研究主要体现在对基因的结构和功能、基因表达的时空调控、核质互作、分子进化规律、物种的起源进化以及线粒体的起源等生物学领域的研究。但是对野桑蚕线粒体基因组的研究目前还处于初级阶段，对中国野桑蚕线粒体方面研究的报道更少。 许多研究证明，“家蚕起源于中国野桑蚕”。目前已经公布了四个家蚕品种和一个日本野桑蚕的线粒体基因组全序列，但中国野桑蚕线粒体基因组的全序列还未见报道，它们之间的系统分析也少有文献。开展中国野桑蚕线粒体基因组的研究，一方面可以丰富线粒体基因组数据库，另一方面通过线粒体基因组比较分析，可以阐明其基因组成、基因排列和基因结构特点及其进化特点，通过系统分析，可以进一步探讨中国野桑蚕与家蚕不同品种、日本野桑蚕的系统演化关系和基因标记的特征。 本论文主要测定和分析了中国野桑蚕线粒体基因组全序列，并且对物种间、品种间mtDNA的进化特点和系统演化等进行了研究。 1．中国野桑蚕线粒体DNA提取方法的建立：由于野外环境的进一步恶化，野生材料越来越少。介于此，为解决材料的时空影响限制。本研究探讨了不同的保存方法和不同细胞破碎方法中国野桑蚕线粒体DNA提取影响，从而建立了一套优化方法。这种方法是先将材料置于-80℃下长期冻存，提取时取出来解冻，研磨与匀浆相结合来破碎细胞，再用常规方法提取线粒体DNA。用这种方法获得的mtDNA既解决了时空限制，又能用于扩增、酶切、克隆和测序。 2．引物的筛选与分析：37个昆虫通用引物中有81％能用于扩增和测序，设计其他区域的引物12个并将其扩增，最终可以完成全序列测定。 3．中国野桑蚕线粒体基因组的分析结果： (1)全序列及其结构分析：通过扩增、克隆、测序和拼接，获得了中国野桑蚕线粒体全基因组序列，全长为15688bp，由13个蛋白质编码基因，2个rRNA基因、24个tRNA基因和AT富集区构成。较4个家蚕品种和1个日本野桑蚕线粒体基因组多2个tRNA，其他组成和排列与这5个序列相同。与其它物种组成和排列都有不同。 （2）酶切图谱：用15种限制酶酶切获得52个位点，其中有24个Taql和互个Pstl酶切位点．与日本野桑蚕和“夏芳”比较，有较大的数目多态性和长度多态性。 （3）突变的比较：与日本野桑蚕比较，有23个编码基因序列发生了突变，共349个突变位点，其中非编码区占277个。与“夏芳”比较，有25个编码基因序列发生了突变，共285个突变位点，其中非编码区136个突变。与日本野桑蚕和“夏芳”的转换／颠换分别为 1．93和 1．84。 川核昔酸的组成及碱基使用偏好性：基因组的碱基组成位于中等，AT含挝较高。 4．中国野桑蚕mtDNA中各类基因的分析： 山蛋白质编码基因：共编码了13个疏水蛋白质，3715个氨基酸。5个起始子为ATG。，7个ATA，1个不明；12个终止子为TAA，l个不明。非极性氨基酸占主导地位，其次是极性不带电的氮基酸。编码线粒体DNA的基因时存在较大的AT偏好性，且更偏好使用T碱基。密码子的各位置组成中T和A含量较高，G和C含量较低。 （2）tRNA的组成及H级结构预测：中国野桑蚕线粒体DNA序列与所比较的其他物种有所不同，包含了24个tRNA，有3个tRNA－Ser，2个tRNA－lie和2个tRNA－Leu，其他17种tRNA都只有一个，并推测出各种H级结构。有17对碱基错配，3对难以匹配，还有1种有四个茎环结构的tRNA（见图13）。大多数密码子序列与相应的反密码子不完全匹配。 （3）rRNA基因及其二级结构预测：有大小两个rRNA，LrRNA和SrRNA，其长度分别是1350hp和784hP。这两个基因与家蚕蛾科的其它各序列相比相似性最高，其次是果蝇和蚊子与人的相似性较低。在自由能最低时，LrRNA基因二级结构有68个主干和69个环状结构组成；SrRNA基因二级结构有9个主干和 10个环状结构组成。 5．中国野桑蚕线粒体基因组的系统分析： O）基于COI部分基因的系统分析发现：日本野桑蚕聚为一类，再与中国安康地区野桑蚕和韩国野桑蚕聚为一类。中国镇江的野桑蚕与家蚕品种C－108聚在一起。其他家蚕品种聚为一类。 （2）基于线粒体基因组和基因的基因树构建与分析发现：分别对6个材料（4个家蚕品种和2个野桑蚕）的线粒体基因组全序列、13个蛋白质编码基因、2个 rRNA基因和 1个非编码区（即 AT富集区）进行了分析，并用 NJ法构建了基因树。从构建的基因树中可知，COI、COil、ATPases、AT宫集区、ND、ND3、ND4L、NDS、COlll、ATPase6的基因树与全基因组的系统树树型基本一致，但在家蚕中也存在品种间的差异；在基因树中还有一些基因，如 cytb、NDZ、ND4、ND6、LrRNA fi SrRNA中野桑蚕和家蚕之间进化规律不太清楚。 由此而知，从线粒体角度可以证明家蚕与中国野桑蚕亲缘关系较近。由于线粒体基因的遗传具有母性遗传的特点，又由于野桑蚕只受自然环境作用，家蚕品种受囱然选择和人工选择的双重作用，从而系统演化过程表现出一定的差异。