【摘 要】
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为研究紫花苜蓿LEA基因抗逆功能,培育紫花苜蓿抗逆品系。本研究从紫花苜蓿“WL525”中克隆到的胚胎晚期富集蛋白基因Ms LEA2,属于LEA_2家族。全长513bp,编码170个氨基酸,其蛋白分子量为18.67k D,等电点为4.42。本研究测定Ms LEA2基因在不同非生物胁迫(PEG、Na Cl和Al)与激素处理下(Me JA、SA和ABA)基因的表达量。实验结果显示Ms LEA2基因可受这
【基金项目】
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国家自然基金面上项目(31272198,31872419 和 31572451); 科技基础资源调查专项“中国南方草地牧草资源调查”(2017FY100603); 上海市绿化和市容管理局科研项目(G162411);
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为研究紫花苜蓿LEA基因抗逆功能,培育紫花苜蓿抗逆品系。本研究从紫花苜蓿“WL525”中克隆到的胚胎晚期富集蛋白基因Ms LEA2,属于LEA_2家族。全长513bp,编码170个氨基酸,其蛋白分子量为18.67k D,等电点为4.42。本研究测定Ms LEA2基因在不同非生物胁迫(PEG、Na Cl和Al)与激素处理下(Me JA、SA和ABA)基因的表达量。实验结果显示Ms LEA2基因可受这三种非生物胁迫与三种激素处理诱导上调表达,并且在不同的胁迫条件下该基因有特定的调控模式。在非生物胁迫下,该基因在叶片中的表达量高于根中。六种环境因素处理后,该基因的表达量都有显著的变化,但并没有呈现相同升降模式。说明Ms LEA2基因可受非生物胁迫诱导上调表达,并且在不同的胁迫条件下该基因有特定的表达模式。构建Ms LEA2基因原核表达载体p HB-Ms LEA2,热激法转化大肠杆菌Rosetta(DE3)。用SDS-PAGE检测后,发现大肠杆菌表达的重组蛋白条带在18k D附近。用Western blot对纯化后的蛋白进行鉴定,实验结果表明得到的蛋白为Ms LEA2蛋白。将构建好的p HB-Ms LEA2-YFP转化GV3101农杆菌,注射烟草叶片,激光共聚焦显微镜观察显示,Ms LEA2蛋白定位在高尔基体上。通过农杆菌介导的遗传转化,将构建成功的植物表达载体p HB-Ms LEA2转化到野生型拟南芥(WT),筛选和鉴定所获得的转基因拟南芥株系,成功得到T3代转基因拟南芥(6个株系)的种子。以转基因拟南芥T3代植株(1、2和4株系)和野生型为材料进行抗旱性研究。在幼苗期,在山梨醇浓度分别为300m M、400 m M和500m M处理下,转基因拟南芥有较高的萌发率,在山梨醇浓度分别为100m M、200 m M、和300m M处理下,转基因拟南芥的根长,鲜重大于野生型拟南芥。在成苗期,通过自然干旱处理,与野生型相比,转基因株系表现出更高的相对含水量和脯氨酸的积累量;在光合系统中,表现较完善的光合系统、Fv/Fm值、叶绿素含量、净光合速率(Pn),并且光系统II(PS II)的光能利用效率(α)和最大相对电子传递速率(r ETRmax)等明显高于野生型;同时转基因植株具有更加完善的抗氧化酶系统,并且丙二醛含量和电导率比野生型低。表明紫花苜蓿Ms LEA2基因在拟南芥中过表达提高了拟南芥的整体抗旱性。以转基因拟南芥T3代植株(1、4和6株系)为材料,从表型、生理和分子生物学三个方面研究铝胁迫下转Ms LEA2基因拟南芥的耐铝毒性能。结果表明:铝胁迫下转基因拟南芥的根长,鲜重和脯氨酸含量均大于野生型,丙二醛含量和电导率则低于野生型且差异显著(P<0.05),检测CAT、POD和SOD酶活也显著高于野生型。初步证明紫花苜蓿的Ms LEA2基因具有提高植物耐铝的能力。
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