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近年来,新发和再发传染病给我国公共卫生与畜禽养殖带来严重挑战,病原的快速筛查与诊断都依赖于实验室的分子生物学检测。纳米孔(Nanopore)测序是牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies,ONT)研发的新一代高通量测序技术。由于其便于携带、长读长和实时数据处理等特点可为疫病快速诊断与处置提供病原信息,革新了传统高通量测序技术在相关领域的应用模式。为了评估纳米孔测序技术在未知病原以及DNA和RNA病毒中的测序性能,因此本研究首次利用纳米孔技术快速确诊了内蒙古阿尔山地区突发的一起饲养野猪未知病原疫情,在接到样品150 min后实时检测出213条非洲猪瘟病毒序列,覆盖其28.1%全基因组序列。进一步纳米孔连接法测序获得1,826条ASFV序列,拼接出99%的全基因组,平均测序深度为5.02x。通过该方案实现了非洲猪瘟疫情的早期检测,在阻击病毒在野猪群体中的传播具有重要意义。为了进一步拓展纳米孔测序技术在病毒性疫病快速诊断中的应用,本研究利用纳米孔RAD004快速建库策略对一份猪圆环病毒和博卡病毒混合感染的阳性病料进行测序探索,成功检测到了17条单股线性的猪博卡病毒序列,2.4x的测序深度,覆盖了87%的基因组,准确度为92%。但是该策略不适用于单股环状DNA病毒的纳米孔测序。本研究为进一步探索纳米孔测序技术在RNA病毒中的应用,因此对单股负链的狂犬病毒末端加Poly A后进行纳米孔直接c DNA测序,12 h后获得1.03 G数据,仅8.7%的覆盖率。而后经LSK109方案测序12 h后获得3.44 G数据,其中包含577条RABV序列。进一步通过设计特异性引物对狂犬病毒L基因进行纳米孔扩增子测序获得1,558条RABV序列,测序深度可达58x,测序准确度达99.2%。随后将连接法测序得到的全部数据用于拼接后获得80.5%全基因组读长。本研究进一步通过PCS109建库策略对低起始样本量的分节段的RNA黄病毒-阿龙山病毒进行了测序研究,获得的599 M数据里包含18条ALSV序列,且涵盖了4条基因节段,经PCR建库后的序列N50仅208 bp,但是以短片段的序列为参考扩增出了1,531 bp的NS3-like基因编码区,辅助了ALSV的全基因组的研究进展。上述研究结果表明,纳米孔测序平台可以很好的应用于新发、再发病原快速鉴定与研究,验证与优化了纳米孔测序在多种DNA/RNA病毒全基因组测序方面的建库流程以及相关的生物信息分析方案,促进纳米孔测序在病毒病防控领域的应用,并为分子病毒学的研究拟提供一种便捷实时高效的基因测序方案,在人兽共患病的防控中体现出重要意义。