近年来,肿瘤的发生率正逐年持续增高,现已成为威胁健康的重大疾病之一。但多数抗肿瘤药物因水溶低,毒副作用大,不良反应明显,以致其临床应用受局限。如何实现肿瘤的有效治疗和药物的靶向递送,一直是研究热点。随着分子生物学,材料医学和纳米技术的日益发展,越来越多优异的载体材料用于抗肿瘤药物的递送,其中血清白蛋白作为一种天然来源的载体,具有良好的生物相容性,靶向性和长的半衰期。又因其独特的结构特点使得部分生理物质如脂肪酸,可以通过疏水或静电作用力插入血清白蛋白的不同结构域中,实现与白蛋白自发结合并在体内进行运输,有研究表明硬脂酸与白蛋白有5个稳定结合的位点。同时,白蛋白结构中34位游离巯基具有高反应活性,能够与马来酰亚胺基发生点击反应实现准确的共价结合,具有高效高选择,反应条件温和的特点,在蛋白修饰中具有重要作用。基于以上原理,本课题合成了三种紫杉醇小分子前药,分别为紫杉醇-硬脂酸（PTX-SA）、紫杉醇-十八烷二酸（PTX-ODDA）、紫杉醇-马来酰亚胺己酰腙（PTX-EMCH）,结构中分别引入能够与白蛋白结合的硬脂酸,十八烷二酸,马来酰亚胺基,在体外状态下实现自发与白蛋白共价或非共价结合,通过“搭便车”的方式实现药物的递送,增加药物水溶性,发挥白蛋白载体的优势;制备方法温和简单,不改变白蛋白构象,不影响其活性,能更好的发挥制剂的靶向性。其中PTX-EMCH中引入具有酸敏感的酰腙键来响应肿瘤的酸性微环境,计划实现更优的抗肿瘤疗效。研究内容分为四部分,如下:1.含有白蛋白结合功能基团的紫杉醇小分子前药的合成和表征PTX中的2’-OH端具有良好的反应活性,经常用做结构修饰的反应位点来制备紫杉醇前药。PTX-SA和PTX-ODDA是通过PTX的2’-OH与脂肪酸中的羧基发生酯化反应一步合成;PTX-EMCH是以乙酰丙酸（LEA）为连接臂,其羧基端与紫杉醇同样通过酯化反应生成紫杉醇-乙酰丙酸（PTX-LEA）,羰基端与6-马来酰亚胺己酰肼三氟乙酸盐（EMCH TFA）的游离肼键反应生成酰腙键,最终得到PTX-EMCH。之后通过1H-NMR和MS对合成的紫杉醇小分子前药的结构进行表征,HPLC验证其纯度。2.白蛋白结合型紫杉醇前药的制备及其理化性质的评价考察紫杉醇前药与HSA的结合能力,并以Abraxane?为对比制剂考察蛋白结合物的理化性质（载药量、粒径、电位、表面形态、稳定性）,制剂制备对白蛋白空间构象的影响,以及药物的体外释放。通过表面等离子共振（SPR）测得PTX-SA与HSA的亲和力强于PTX,总巯基含量检测试剂盒测得HSA中有0.77±0.05的游离巯基实现与PTX-EMCH的共价结合,HPLC法进一步验证PTX-EMCH与HSA的结合能力,红外表征了PTX-EMCH-HSA的成功合成。通过载药量与包封率筛选出HSA与PTX-SA、PTX-ODDA的投料比为1:5,前药的载药量分别为PTX-SA5.57%±0.22%、PTX-ODDA7.56%±0.3%。当投料比 HSA:PTX-EMCH=1:2 时,测得 PTX-EMCH 的载药量为 1.37%±0.1%,PTX-EMCH与HSA的载药摩尔比为0.80±0.06。通过马尔文粒径与Zeta电位分析仪测得PTX-ODDA/HSA、PTX-SA/HSA 与 Abraxane?的粒径相似且 PDI 均小于 0.3;PTX-EMCH-HSA的粒径较小,分布较宽,平均粒径19.51 nm,PDI0.45,更接近白蛋白本身的状态。PTX-ODDA/HSA、PTX-SA/HSA 和 Abraxane?的电位较为相似,而 PTX-EMCH-HSA 的电位更接近HSA的电位。透射电镜结果与上述粒径结果基本一致。稳定性结果显示制剂 PTX-ODDA/HSA、PTX-SA/HSA、PTX-EMCH-HSA 在 25℃和 4℃条件下放置 96h 后粒径无明显变化,制剂较为稳定,而Abraxane?在4℃下放置96 h出现了粒径变大的情况,说明其在4℃条件下稳定性差。CD结果显示制剂中蛋白质的二级结构均得到了很好的保持。体外释放结果显示PTX-EMCH-HSA在pH 5.5的PBS缓冲液（含0.5%吐温80）中释放PTX-LEA的行为呈现酸敏感性,Abraxane?在pH 5.5和pH 7.4的缓冲液中PTX的释放行为相一致,PTX-ODDA/HSA、PTX-SA/HSA的酯键较为稳定,在pH 5.5和pH 7.4的缓冲液中PTX的释放不足20%。3.白蛋白结合型紫杉醇前药的体外抗肿瘤评价选用B16F10细胞和MCF-7细胞作为实验细胞株,游离药和蛋白制剂的细胞毒性作用考察方法为MTT法;考察两种细胞对制剂的摄取行为以及探究HSA介导的主动靶向作用是通过荧光显微镜定性和流式细胞术定量的方法;使用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒考察结合物诱导细胞凋亡的能力;通过DNA含量检测试剂盒（细胞周期）来考察制剂对细胞周期的阻滞作用。实验结果表明,前药蛋白制剂在一定的药物浓度下均有较高的细胞毒性作用;与游离香豆素6相比,以白蛋白为载体增加了药物的摄取,且HSA在MCF-7细胞中表现出了主动靶向作用,B16F10细胞作用不显著;制剂PTX-EMCH-HSA与Abraxane?对两种细胞具有相似的诱导凋亡作用,而PTX-ODDA/HSA和PTX-SA/HSA在B16F10中显示出更高的凋亡效果,在MCF-7中显示出低于Abraxane?的凋亡效果;细胞周期实验结果表明蛋白制剂均可阻滞细胞周期G2/M期,但PTX-EMCH-HSA和Abraxane?对细胞的阻滞作用强于 PTX-ODDA/HSA 和 PTX-SA/HSA。4.白蛋白结合型紫杉醇前药的体内抗肿瘤活性评价建立了昆明小鼠荷载B16F10黑色素瘤模型,采用尾静脉注射的方式给药。制备包载荧光物质Dir的前药蛋白结合物,得到Dir@PTX-SA/HSA、Dir@PTX-ODDA/HSA和Dir@PTX-EMCH-HSA,利用活体成像技术对活体与离体器官进行成像分析,评价蛋白结合物在体内的靶向作用与分布情况。用Taxol和Abraxane?作为对比制剂,小鼠肿瘤体积变化为指标考察PTX-SA/HSA、PTX-ODDA/HSA和PTX-EMCH-HSA的体内抗肿瘤效果,以给药小鼠的体重变化为依据考察制剂安全性;对治疗完成后的小鼠器官和肿瘤进行剖取并H＆E染色,观察各制剂对小鼠各脏器的毒性和对肿瘤组织的破坏作用。成像结果表明,相较于Dir,三种蛋白制剂均可通过被动或者主动的方式靶向肿瘤部位;抑瘤结果显示,给药治疗组均有较好的抗肿瘤疗效,其中蛋白制剂组的抗肿瘤疗效均强于Taxol,在一定的给药剂量下,制剂PTX-EMCH-HSA与Abraxane?具有相似的抗肿瘤疗效,PTX-ODDA/HSA、PTX-SA/HSA稍弱;Taxol治疗组小鼠的体重稍下降,而其他给药治疗组体重保持平稳,说明相较于Taxol,以白蛋白为载体的制剂毒副作用较小;H＆E染色实验结果显示,制剂仅表现出了对肿瘤组织的破坏但并未显示出明显的脏器毒性,因此,具有一定的生物安全性。