硫磺熏蒸(简称硫熏)在药材的产地加工中通常作为防霉保质的方法,在一定程度上可以延长药材的保质期,但近年来滥用、误用情况较为严重,已引起国家相关部门高度重视。目前,国家已出台相关措施控制中药材硫熏,但检控手段仍有待完善。对于硫熏中药材药理药效研究,可能由于药材硫熏程度的不同,研究结果不一致,使得硫熏工艺的合理性仍存在极大争议。另一方面,硫熏药材对复方制剂品质影响的研究尚不足。本文以牡丹皮、含牡丹皮的中药方剂犀角地黄汤和中药制剂六味地黄丸为研究对象,系统考察硫熏程度对药材、方剂及成药品质的影响,揭示硫熏引起药材和制剂化学成分变化的规律;在此基础上,创建以特征含硫衍生物为指标的硫熏药材和相关中成药的快速筛查方法,为硫熏牡丹皮检控标准的修订提供科学依据,也为药材硫熏工艺传承和创新研究提供新思路。全文共分6个部分:一、文献研究对硫熏导致药材化学成分组成和含量改变,潜在药效和毒性变化,以及硫熏药材多种检控方法进行了系统综述和评价。在此基础上提出必须应用现代分析技术加强硫熏程度对药材和方剂整体质量的影响研究,在硫熏药材药效和毒性评估不完善的情况下需建立专属性强的硫熏药材检控方法,加强硫熏药材和相关制剂的检控。二、硫熏前后牡丹皮定性比较首先采用UPLC-QTOF-MS/MS化学轮廓表征方法揭示硫熏对牡丹皮药材成分的影响。共鉴定了 42个成分,包括11个单萜及其苷类,9个没食子苷类,6个酚酮类,4个黄酮类以及2个其他类成分。其中,硫熏后产生了 Paeoniflorin sulfonate,Oxypaeoniflorin sulfonate 和 Benzoylpaeoniflorin sulfonate 3 种新的含硫衍生物。其次,采用基于UPLC-QTOF-MS/MS的代谢组学结合特征离子提取手段,运用多元统计分析方法,发现硫熏牡丹皮中潜在特征标志物,并用半定量的方法探讨了特征含硫衍生物及其前体化合物含量随硫熏时间的变化规律。发现硫熏会显著影响牡丹皮的整体质量,硫熏诱导的蒎烷单萜苷成分的化学转化是整体质量变化的重要因素;特征含硫衍生物的碎片离子m/z 259.02可以用作诊断离子,筛查硫熏牡丹皮中单萜苷类成分含硫衍生物。本策略与前人研究相比,检测速度快,专属性强。三、硫熏前后牡丹皮活性成分定量比较利用UPLC-QTOF-MS/MS二级质谱结合提取离子模式,建立了模拟TQ-MS/MS中多反应监测模式(MRM)的定量方法,并与全扫描模式及紫外检测模式进行对比,发现QTOF-MS/MS模拟MRM方法在线性、专属性及灵敏度上均优于其余两种方法;应用此法对不同硫熏程度牡丹皮化学成分定量分析,发现硫熏引起了牡丹皮化学成分含量变化,不同硫熏程度对不同化学结构类型成分的影响程度也不同。由于各成分水溶性差别,水煎煮过程可能会将这种影响趋势扩大或改变。四、硫熏对含牡丹皮方剂品质的影响利用代谢组学结合UPLC-QTOF-MS半定量方法分别从汤剂pH、小分子成分的PCA分析、主要活性成分半定量分析以及含硫衍生物种类四方面探讨了不同硫熏程度牡丹皮对犀角地黄汤品质的影响,发现在即使用二氧化硫残留量低于药典限量的牡丹皮所煎煮的汤剂中,仍可检测到芍药苷亚硫酸酯,说明硫熏对牡丹皮药材化学成分的影响会延续到方剂。五、特征含硫衍生物对牡丹皮检控的意义采用UPLC-QTOF-MS/MS和中国药典二氧化硫残留检测法,考察不同硫熏时间和贮藏8个月前后牡丹皮样品以及部分商品牡丹皮中二氧化硫残留量与其特征含硫衍生物含量的变化规律,比较二氧化硫残留量和特征含硫衍生物的量作为硫熏牡丹皮检控指标的适用性,发现特征含硫衍生物作为硫熏牡丹皮检控指标更具优势。因此,建立了以特征含硫衍生物为指标的硫熏牡丹皮快速筛查方法,成功用于商品牡丹皮的检测。六、中成药中硫熏牡丹皮检测方法以含牡丹皮的中成药六味地黄丸为例,建立中成药中以芍药苷亚硫酸酯为指标的硫熏牡丹皮专属检测方法,并对UPLC-PDA方法及UPLC-QTOF-MS/MS方法进行综合比较。采用所建立的两种筛查方法对市场上随机收集到的10批商品六味地黄丸样品进行检测,发现有9批商品所用牡丹皮原料为硫熏品。综合分析专属性、灵敏度和耐用性,以UPLC-QTOF-MS/MS方法较优。另外,建立了以芍药苷亚硫酸酯为指标,可以客观反映牡丹皮药材及其制剂用原料牡丹皮硫熏程度的UPLC-QTOF-MS/MS定量方法。