活菌载体疫苗是将异源抗原基因插入活细菌的染色体或质粒载体中,激发免疫系统提呈异源抗原并产生免疫保护,从而达到预防一种或多种疾病的新型疫苗。活菌载体疫苗不但能诱发机体产生体液免疫,而且能产生细胞免疫和黏膜免疫应答。一直以来,以沙门氏菌(Salmonella)为出发菌株是此类疫苗载体研究的一个热点,而且利用遗传学方法对其进行减毒改造越来越受到人们的重视。伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhi)Ty2株是一种对人专性致病的野生毒株,具有很强的免疫原性和反应原性。相关研究报道,目前在研的多种疫苗载体候选株都是以其为出发菌种进行减毒及后续研究的,但是由于现有载体自身的免疫原性过高而容易掩盖其递送的外源抗原的免疫反应,这提示我们有必要研究和构建更加安全有效的新型沙门氏菌疫苗载体。本研究旨在通过敲除S.ty2染色体上新的毒力调控基因rfaH和毒力相关基因ssaV,并评价减毒株的安全性,进而将异源目的基因敲入减毒株基因组构建外源基因表达系统,并进行免疫学评价,以期得到一种新型的减毒沙门氏菌疫苗载体,为建立新型的异源抗原递送疫苗研究奠定基础。首先,以伤寒沙门氏菌S.ty2基因组中编码抗转录终止蛋白的rfaH基因为靶标,通过对一系列实验条件的摸索,确定了打靶的技术关键点,包括制备感受态所用的培养基、打靶片段的同源臂长度、线性DNA的纯度和浓度、以及L-阿拉伯糖的加入时机等,建立了λRed体内重组系统在伤寒沙门氏菌S.ty2中进行基因敲除的实验方法,最终实现了靶基因的敲除,并通过PCR以及RT-PCR的方法分别在基因水平和RNA水平进行了确证。运用已建立的这套方法,又敲除了另一个毒力相关基因ssaV基因,构建得到S.ty2的rfaH和ssaV双敲除株。对以上菌株进行相关的表型分析,LPS银染实验显示rfaH基因敲除导致脂多糖(LPS)层减少,且O抗原几乎不再表达;软琼脂泳动实验和透射电子显微镜观察都证明rfaH基因敲除影响了细菌鞭毛形成。菌体O抗原和鞭毛抗原不仅是沙门氏菌血清分型的重要基础,而且是与菌体毒力密切相关的蛋白,在菌体入侵宿主细胞并在其内增殖的过程中起重要作用;因此,新构建的双敲株具有显著的减毒表型,为后续疫苗载体研究打下实验基础。接着,对得到的减毒株分别从体外细胞水平以及小鼠体内水平进行安全性评价。体外通过细菌感染RAW246.7细胞进行侵袭力以及24h胞内生存力实验,表明rfaH基因敲除导致侵袭力增强、而胞内生存力降低。在体内水平实验,一方面用S.ty2及其双敲除突变株鼻饲感染小鼠,取各组小鼠肺脏做病理切片,以分析各菌株的毒力;结果表明,无论在急性期还是亚急性期,双敲除株的肺部病理变化较野生株的都明显减轻,但未观察到小鼠死亡,因而无法计算和比较半数致死量(LD50)。另一方面,为了更好地在小鼠模型中评价减毒株的安全性,我们同时用鼠伤寒沙门氏菌1.1174平行地做了rfaH和ssaV基因敲除工作。用鼠伤寒沙门氏菌1.1174及其ΔrfaHΔssaV双敲除株分口服和腹腔注射两种途径感染小鼠,结果显示:在口服感染中,1.1174双敲株较对照株1.1174的LD50至少升高了105倍;而在腹腔注射感染中,双敲株的LD50较对照株1.1174至少升高了103。从体外和体内水平都已证明双敲除株ΔrfaHΔssaV减毒效果十分显著。最后,应用基因重组的方法,将编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告基因egfp敲入已构建的减毒菌株S.ty2ΔrfaHΔssaV染色体,与外膜蛋白A (OmpA)的C-端融合表达于载体菌株表面,在荧光共聚焦显微镜下观察到绿色荧光,说明报告基因表达。采用同样的方法并在减毒株染色体上选择相同靶标,将幽门螺杆菌保护性抗原尿素酶B(UreB)基因片段敲入S.ty2ΔrfaHΔssaV的相同位置,得到重组菌S.ty2ΔrfaHΔssaV-ureB,通过用UreB单抗A3C10进行免疫印迹分析以及间接免疫荧光,都证实目标蛋白呈现表达于菌体表面。为了对上述新型沙门氏菌载体表达系统的有效性进行检验评价,分别采用经鼻饲途径和口胃途径将表达系统S.ty2ΔrfaHΔssaV-ureB免疫小鼠。在鼻饲免疫后,无论高剂量组还是低剂量组都有效地激发了机体针对外源抗原UreB的免疫反应,抗外源抗原的IgG滴度为1:3200,抗载体菌的IgG滴度为1:3200-1:6400。而口服免疫后,高、低剂量组也都有效地激发了机体针对外源抗原UreB的免疫反应,抗外源抗原UreB的IgG滴度为1:3200-1:6400,而抗载体菌的IgG滴度为1:6400-1:12800,且每只小鼠的抗载体菌与抗外源抗原UreB的IgG滴度大小具有对应关系。肠洗液sIgA的滴度与阴性对照差别显著,表明口服免疫的两组都产生了UreB特异性抗体IgA,引起了黏膜免疫应答。综合以上免疫学评价结果,此表达系统不仅能同时激发外源抗原特异性和疫苗载体特异性的有效体液免疫应答,而且能刺激机体产生有效的黏膜免疫反应。本研究的结果证实了应用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌染色体上毒力相关基因,并以此构建活菌疫苗载体的方法是可行的。以敲除rfaH构建减毒外源抗原载体是一种新的策略,这为构建安全有效的重组活疫苗提供了新的方法。这些工作为活菌载体疫苗的更深入研究和临床应用提供了重要的理论基础和实验依据。