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疟疾是由原虫类寄生虫疟原虫感染引起的热带疾病,是目前危害人类健康的主要传染性疾病之一。感染地区主要分布在撒哈拉沙漠以南的非洲地区以及东南亚。5岁以下的儿童是疟疾易感人群。感染疟疾的病人表现出严重贫血、代谢性酸中毒、肺衰竭以及脑疟等病理特征。抗疟疾类药物是目前最有效的控制和治疗疟疾的手段。然而由于耐药疟原虫株的出现,尤其在东南亚地区出现耐青蒿素的疟原虫株,使得疟疾防治工作面临越来越大的困难,因此,人们寄希望于高保护效率的疟疾疫苗。研究疟原虫基因的功能以及疟原虫与宿主之间的相互作用将为研发疟疾疫苗和发现新的抗疟药物靶标提供可靠的信息。疟原虫生长发育的红细胞期(红内期)阶段,是引起疟疾病人严重临床病理的阶段,此阶段,疟原虫是单倍体基因组,因此使用永久性基因敲除技术无法研究必需基因的功能。在我们的研究中,我们使用小鼠伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)和夏氏疟原虫(Plasmodium chabudi)作为疟疾研究的模型进行以下几个问题的探索和研究(i)在伯氏疟原虫探索建立了四环素诱导基因表达系统(Tetracycline-induced gene expression system,Tet-on);并采用该系统条件性敲除红内期P.berghei己糖转运体(Hexose Transporter 1,HT1)基因;分析研究了该遗传致弱性全虫疫苗的疫苗效能。(ii)研究红内期P.berghei硫辛酸蛋白连接酶1(Lipoic acid protein ligase 1,LplA1)基因的功能,并探究可能的代偿途径(iii)在P.chabaudi中尝试建立条件性基因敲除系统,比较研究疟原虫与宿主细胞之间的相互作用。1.条件性敲除系统的建立及全虫疟疾疫苗的研究全虫疟疾疫苗被认为是最有效的疟疾疫苗策略,然而由于现有的疟疾全虫疫苗策略存在很多技术上的问题,从而限制了这些全虫疟疾疫苗进入临床研究。在本研究中,我们使用Tet-on系统条件性敲除了红细胞期P.berghei的必需基因己糖转运体(HT conditional knockout,HT-cKO),分析了 HT-cKO疟原虫的表型特症,并研究了 HT-cKO致弱性疟原虫感染诱导免疫保护力的效果。HT-cKO转基因疟原虫感染小鼠后,在提供无水四环素(anhydrotetracycline,ATc)的情况下,可以正常增殖和持续提供大量的转基因全虫疫苗;但在不提供ATc的情况下,转基因疟原虫的生长受到严重抑制,表现为自灭性感染过程,这些清除了 HT-cKO疟原虫初次感染的小鼠对野生型疟原虫攻击感染表现出完全的免疫保护力。进一步分析表明,HT-cKO疟原虫在小鼠体内连续传代未检测到回复突变,表明该转基因疟原虫是遗传稳定的,具有免疫原性的,同时也可以大规模培养供给疫苗使用。该研究结果表明,采用条件性敲除系统建立遗传可控致弱并可诱导理想的免疫保护力的转基因疟原虫是开发全虫疟疾疫苗的一条可行途径。2.红内期P.berghei拥有硫辛酸拯救代偿途径硫辛酸是α-酮酸脱氢酶(α-ketoacid dehydrogenase,KADH)多酶复合物和甘氨酸切割系统(Glycine Cleavage System,GCV)的必需辅因子,这些脱氢酶复合物主要参与能量代谢、脂肪酸生物合成和氨基酸降解。在顶复门微生物的研究中发现,硫辛酸蛋白连接酶1(LplA1)和硫辛酸蛋白连接酶2(LplA2)催化从环境中摄取的外源硫辛酸连接到线粒体定位的多酶复合物E2亚单位上,而辛酰载体蛋白(ACP)-N-辛酰转移酶(octanoyl-[aycl carrier protein]:protein N-octanoyltransferase,LipB)和硫辛酸合成酶 A(Lipoic acid synthase,LipA)是定位在顶复门微生物的顶体中,催化硫辛酸的生物合成,将硫辛酸连接到丙酮酸脱氢酶复合物的硫辛酸结构域。上述硫辛酸蛋白连接酶或合成酶在硫辛酸利用中的功能有初步研究,但在顶复门微生物中的相互关系则尚未阐明。我们利用Tet-on系统条件性敲除了红内期P.berghei的LplA1基因(LplA1 conditional knockout,LplA1-cKO)并且分析研究了 LplA1-cKO疟原虫的表型变化和特征。结果表明,在不提供ATc时,LplA1-cKO疟原虫在感染的前八天生长被严重的抑制,而八天之后转基因疟原虫恢复了生长增殖能力。我们用实时定量PCR分析LplA1基因和LplA2基因的mRNA表达,并发现,在缺失LplA1的条件下,Lp1A2代偿性增高表达以补偿了 LplA1的功能。由此得出结论:红内期P.berghe 有选择性硫辛酸拯救途径,LplA2可能是LplA1的代偿基因。3.夏氏疟原虫P.chabaudi建立条件性基因敲除系统伯氏疟原虫P.berghei在小鼠可引起致死性感染,但夏氏疟原虫P.chabaudi感染后,小鼠能清除疟原虫的感染。此外,小鼠夏氏疟原虫P.chabaudi与人恶性疟原虫P.falciparum在许多生物学特征上表现出相似性。我们试图在P.chabaudi中建立条件性敲除系统,以便将致死型P.berghe 和非致死型P.chabaudi两种疟原虫做同步比较研究,以揭示不同种属疟原虫特定基因功能的差异以及疟原虫在网织红细胞和成熟红细胞中代谢的不同特点。虽然在P.chabaud 疟原虫中成功转入了条件性基因敲除质粒,并验证质粒被整合到疟原虫基因组,但由于该疟原虫生存力较低,我们未能成功克隆获得基因型一致的转基因P.chabaudi疟原虫。