【摘 要】
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红曲菌是一种药食两用的丝状真菌,其在发酵过程中可以产生色素、Mona colin K等多种次级代谢产物,它们具有抗癌、降脂、抑菌等功效。然而,红曲菌也会产生一种真菌毒素—桔霉素,其具有致畸、致癌、致突变的作用,从而限制了红曲菌更广泛的应用。探索一种安全可靠、操作简便的降低桔霉素方法,解决红曲菌产桔霉素的问题具有重要的实际意义。CRISPR/Cas9基因编辑技术能够进行精准定点的编辑,具有操作简便、
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红曲菌是一种药食两用的丝状真菌,其在发酵过程中可以产生色素、Mona colin K等多种次级代谢产物,它们具有抗癌、降脂、抑菌等功效。然而,红曲菌也会产生一种真菌毒素—桔霉素,其具有致畸、致癌、致突变的作用,从而限制了红曲菌更广泛的应用。探索一种安全可靠、操作简便的降低桔霉素方法,解决红曲菌产桔霉素的问题具有重要的实际意义。CRISPR/Cas9基因编辑技术能够进行精准定点的编辑,具有操作简便、高效率等优点,为基因编辑提供了一种新的方向。因此,本论文主要的目的是探索CRISPR/Cas9基因编辑技术在红曲菌中的应用,试图从分子生物学的角度解决红曲菌产桔霉素的问题,同时为红曲菌基因组的编辑寻求一种新的方法。本文首先探讨了 sgRNA和spCas9在体外对目的基因的酶切效果;然后根据体外验证试验的结果选择一条sgRNA用于载体构建;最后研究了载体导入菌体后对菌体生长的影响以及目的基因是否发生突变或缺失。主要研究结果如下:1.在红曲米的发酵培养中加入黄酮类化合物,30 g大米中添加1%金雀异黄酮可以降低桔霉素31.3%,添加1%木犀草素,桔霉素的产量可以降低37.7%。2.三条sgRNA的体外酶切试验中,位于pksCT基因的第一个外显子上的第一个靶点的体外酶切效果最好,酶切效率可以达到75%。3.108个/mL红曲菌孢子悬液在潮霉素平板上培养7 d,80 μg/mL的潮霉素能完全抑制红曲菌的生长。4.PBARGPE1-Hygro-EGFP质粒为真菌表达质粒,其中EGFP基因所对应的gpdA启动子和trpC终止子,通过荧光蛋白分析,可以确定gpdA启动子在红曲菌中可以发挥作用。5.通过测序结果分析,确认Ps6C以及Ps敲除载体的构建成功。6.Ps质粒转入红曲菌后在抗性平板上可以生长,而没有转Ps质粒的红曲菌则不能生长,证明质粒已成功转入红曲菌。
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