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研究背景NRF2(NF-E2 p45-related factor 2)-KEAP1(Kelch-like ECH-associated protein 1)信号通路是机体重要的防御系统之一。KEAP1是NRF2的主要调控蛋白,介导其泛素化降解,从而维持了正常细胞中NRF2的稳态平衡。核受体作为一种不依赖于KEAP1的NRF2调控途径起作用。但在许多肿瘤细胞中,KEAP1的突变会引起NRF2的持续高表达。异常激活的NRF2可以通过调控其下游的抗氧化酶,二相解毒酶以及代谢相关的酶,促进肿瘤的恶性增殖和耐药,因此NRF2也被认为是一种癌基因。前期的研究发现,核受体维甲酸受体alpha(Retinoic acid receptor alpha,RARα)和视黄酸 X 受体 alpha(Retinoid x receptor alpha,RXRα)抑制 NRF2 的转录活性。在急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)中,早幼粒白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PML)基因和RARα基因发生融合,产生了癌基因PML-RARα。融合蛋白PML-RARα的表达使得PML蛋白和RARα蛋白无法发挥正常作用,从而导致细胞分化停滞,凋亡受到抑制和自我更新能力增强。因此,PML-RARα也是急性早幼粒细胞白血病的分子标记物和致病基因。RARα对NRF2的活性具有抑制作用,还有研究报道PML也可以降解NRF2,说明PML-RARα与NRF2存在相关性,那么PML-RARα对NRF2的抑制作用是否存在;虽然融合蛋白在细胞内主要以长型(PML-RARα-Long iso form,PR-L)和短型(PML-RARα-Short isoform,PR-S)两种形式表达,但由于它们在细胞中的分布不同,它们对NRF2活性的影响是否有差别。目的基于上述科学问题,本课题拟通过建立PR-S、PR-L分别过表达的细胞模型,探究PML-RARα对NRF2的调控作用及其机制。方法1.载体构建a.以内源表达PR-L的NB4细胞的cDNA为模板进行PCR扩增,将编码PR-S或PR-L的序列分别克隆到p3XFLAG质粒载体和pFuipw慢病毒载体上。b.以NB4细胞的cDNA为模板进行PCR扩增,将编码PR-S、PR-L突变体的序列分别克隆到p3XFLAG质粒载体上。c.以mRARα全长序列为模板进行PCR扩增,将编码mRARα突变体的序列分别克隆到pET41a或pEGFP-C1载体上。2.细胞株构建将pFuipw-PR-S、pFuipw-PR-L以及pFuipw空载体分别与慢病毒包装质粒共转入HEK293T细胞中,收集含病毒的细胞上清液,通过超速离心浓缩,并利用免疫荧光的方法检测其感染效率。利用适量的细胞培养液感染Hela细胞后,再利用嘌呤霉素进行筛选,随后将单个细胞分离、扩增并鉴定。3.PR-S、PR-L对NRF2信号通路的影响研究方法a.利用SDS-PAGE和Western blot(WB)方法分析NRF2靶蛋白HO-1的表达。b.利用双荧光素酶报告基因系统分析NRF2转录活性变化。4.PR-S、PR-L对NRF2信号通路调控的机理研究方法a.利用重组蛋白表达、免疫共沉淀(IP)和WB方法研究PR-L与NRF2在细胞内的相互作用。b.利用人源真核细胞表达重组蛋白、免疫荧光方法分析PR-S、PR-L分别和NRF2在细胞内的共定位。c.利用人源真核细胞、大肠杆菌表达的重组蛋白,通过IP、GST沉降实验(GST pull-down)和WB的方法研究PR-S或PR-L和NRF2之间的相互作用及其位点。结果1.成功构建了 PR-S、PR-L分别表达的p3XFLAG质粒和pFuipw慢病毒质粒;成功构建了 PR-S、PR-L它们各自突变体分别表达的p3XFLAG质粒;成功构建了mRARα突变体分别表达的pET41a或pEGFP-C1质粒。通过对质粒进行测序分析,并将测序结果与发表序列比对,发现基因序列正确;为了进一步验证质粒能否正确、有效地表达,又将质粒过表达至原核或真核细胞中,WB结果显示重组蛋白的分子量正确。2.成功构建了对照、PR-S和PR-L分别过量表达的单克隆细胞株,它们分别为 Hela-Fuipw、Hela-PR-S2、Hela-PR-S7、Hela-PR-L14 以及 Hela-PR-L20。单克隆细胞株中的PR-S、PR-L蛋白在细胞中的定位与质粒瞬时表达所得结果一致。尽管单克隆细胞株中PR-S、PR-L蛋白表达水平差别较大,但利用多克隆、单克隆细胞株分别进行同一实验,所得结果相似;用同一种单克隆细胞株传代后的重复实验结果可比性好。综上所述,成功构建了表达重组融合蛋白的Hela细胞模型。3.PR-S和PR-L对NRF2信号通路有促进作用a.NRF2激活剂叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)的处理可以显著增加多克隆细胞株(Hela-PR-S和Hela-PR-L)、单克隆细胞株(Hela-PR-S7和Hela-PR-L14)中NRF2靶蛋白HO-1的表达,且明显高于对照细胞株,呈剂量依赖效应。b.Hela-PR-S、Hela-PR-L、Hela-PR-S7 以及 Hela-PR-L14 细胞株在不同浓度(μM)的tBHQ处理24h后,相比于对照细胞株Hela-Fuipw,荧光素酶的活性都有更大的升高,说明融合蛋白促进NRF2的转录活性。4.PR-S、PR-L融合蛋白与NRF2相互作用a.细胞内相互作用IP和WB结果表明重组的长型融合蛋白与NRF2不仅形成复合体,而且随着NRF2的表达量增加,它们之间相互作用也更明显。b.细胞内共定位在HEK293T细胞中,重组PR-L融合蛋白和NRF2主要位于细胞核中,重组PR-S融合蛋白在细胞核中和细胞质中都有分布,但是融合蛋白PR-S、PR-L与NRF2的共定位都集中在细胞核内;在Hela细胞中,两种重组融合蛋白在细胞中的分布与HEK293T细胞一致,与NRF2共定位也只存在于细胞核中;在NB4细胞中,融合蛋白PR-L和NRF2的共定位也位于细胞核内,且随着NRF2的表达增加,共定位也显著增强。c.体外直接相互作用利用在真核细胞和大肠杆菌中分别表达的RARα全长和突变体重组蛋白,以及大肠杆菌中分别表达的NRF2全长和突变体重组蛋白,通过系统的相互作用分析,研究结果表明融合蛋白上RARα的中间区域(interfingerregion,IF)和C端Ⅱ号锌指结构(C-terminal CⅡ finger,CⅡ)区域与NRF2的N端结构域相互作用。结论本课题发现了无论是长型还是短型融合蛋白PML-RARα对NRF2信号通路不仅没有抑制作用,而且反过来具有激活作用;明确了融合蛋白与NRF2在细胞内的相互作用,并且确定了相互作用的位点是融合蛋白上RARα的IF和CII区域以及NRF2的N端结构域。该项研究在一定程度上解释了融合蛋白对NRF2调控的分子机制,并为进一步研究APL中耐药机制奠定了基础。