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发酵辣椒是湖南的特产,湘菜的主要调味品。目前,针对发酵辣椒的研究主要集中在菌种选育、香气成分分析、工艺优化等方面,自然发酵辣椒不同发酵阶段微生物的多样性及其所扮演的角色尚不清楚。本研究采用454焦磷酸测序技术,对线椒和米椒发酵前后微生物的多样性进行了研究,采用RNA-Seq测序技术,对新鲜线椒和自然发酵第20d的线椒中活性微生物的non-rRNAs进行了物种和功能注释,旨在揭示辣椒自然发酵过程中微生物的群落组成和功能,为发酵辣椒质量控制提供科学依据,主要研究结果如下:1、采用454焦磷酸测序技术对线椒和米椒发酵前后细菌的多样性进行了研究,结果如下:(1)新鲜线椒中的细菌可归属到5个门、8个纲、15个目、27个科、35个属,相对丰度大于1%的细菌有17个属,主要以Rhizobium、Aureimonas和Stenotrophomonas为主,相对丰度分别为41.51%、6.92%和6.92%;新鲜米椒中的细菌可归属到5个门、7个纲、13个目、27个科、38个属,相对丰度大于1%的细菌有11个属,主要以Aureimonas、Rhizobium和Lactobacillus为主,相对丰度分别为25.62%、23.97%和7.82%。(2)线椒自然发酵过程中的细菌可归属到14个门、26个纲、44个目、86个科、166个属、236个种,相对丰度大于1%的细菌共有20个属,优势细菌为Weissella、Lactobacillus和Rhizobium。米椒自然发酵过程中的细菌可归属到10个门、23个纲、33个目、64个科、124个属、169个种,相对丰度大于1%的细菌共有14个属,优势细菌为Weissella、Lactobacillus、Aureimonas和Rhizobium。2、采用454焦磷酸测序技术对线椒和米椒发酵前后真菌的多样性进行了研究,结果如下:(1)新鲜线椒中的真菌可归属到3个门、12个纲、16个目、23个科、26个属、36个种,其中相对丰度大于>1%真菌有3个属,分别为:Debarvomvces2.69%、Rhodotorula2.39%和Trichosporon2.28%;新鲜米椒中的真菌可归属到3个门、15个纲、16个目、38个科、53个属、79个种,相对丰度大于1%的真菌有6个属:Trichosporon24.11%、Rhodotorula 7.4%、Cladosporium 4.26%、Debarvomvces 3.94%、Mucor 2.51%和Cryptococcus 1.86%。(2)线椒自然发酵过程中的真菌可归属到3个门、13个纲、20个目、30个科、39个属、56个种,相对丰度大于1%的真菌共有8个属,分别为:Hanseniaspora、Debaryomyces、Rhodotorula、Trichosporon、Cladosporium、Cryptococcus、Guehomyces和Pichia。米椒自然发酵过程中的真菌可归属到3个门类、17个纲、29个目、41个科、60个属、96个种,相对丰度大于1%的真菌共有10个属,分别为:Hanseniaspora、Debaryomyces、Rhodotorula、Trichosporon、Cladosporium、Cryptococcus、Pichia、Meyerozyma、Mucor和Hyphopichia。3、采用Illumina Hiseq4000对线椒发酵前后微生物的RNA进行测序,序列经优化、组装和去冗余后,得到非冗余基因集,对非冗余基因集进行物种注释,结果如下:(1)构建了一个含5490条非冗余基因的微生物非冗余基因集。(2)新鲜线椒中活性微生物组成为:细菌88.55%,真菌5.73%,未知分类5.72%,自然发酵第20d的线椒中微生物的组成为细菌99.95%,真菌0.00015%,未知分类0.0499%。(3)新鲜线椒中活性细菌可归属到1个门、1个纲、2个目、4个科、4个属、10个种,活性真菌可归属到1个门、1个纲、1个目、1个科、1个属、1个种;自然发酵第20d的线椒中活性细菌可归属到3个门、3个纲、5个目、11个科、15个属、61个种,活性真菌可归属到2个门、2个纲、2个目、2个科、2个属、2个种。(4)在种水平,新鲜线椒中检测到了10种具有明确分类地位的活性微生物,包括9种细菌,1种真菌,占总微生物转录本的76.80%,5种没有明确分类地位的细菌,占总微生物转录本的23.20%。具有明确分类地位的活性微生物主要有Lactobacillus plantarum 40.15%、Staphylococcus epidermidis 38.85%、Staphylococcus lugdunensis8.77%、Melampsora larici-populina 7.52%和Staphylococcus caprae 2.64%。(5)在种水平,自然发酵第20d的线椒中检测到了具有明确分类地位的活性细菌61种,活性真菌2种,占微生物总转录本的72.50%;没有明确分类地位的活性细菌12种,占微生物总转录本的27.50%。具有明确分类地位的活性细菌主要为Lactobacillus plantarum 95.16%和Weissella paramesenteroides 1.66%。4、对新鲜线椒及自然发酵第20d的线椒中微生物非冗余基因集进行功能注释和差异表达分析,研究基因的表达调控路径、挖掘功能基因并筛选出重要的差异表达基因,结果如下:(1)新鲜线椒和自然发酵第20d的线椒分别获得1048条和4442条非冗余基因,通过KEGG分别注释上199条和2325条功能基因、176条和183条代谢路径,通过eggNOG分别注释上495条和3591条功能基因、23个和22个分类功能,通过GO分别注释上280条和1463条功能基因。(2)新鲜线椒注释到KEGG上的微生物有Staphylococcus epidermidis和Lactobacillus plantarum,自然发酵第20d的线椒中注释到KEGG上的微生物有79种,主要包括Lactobacillus plantarum、Weissella paramesenteroides、Lactococcus lactis等。(3)新鲜线椒和自然发酵第20d的线椒在KEGG上注释到亚硝酸盐代谢路径3条、氨基酸代谢路径18条、乳酸合成路径2条、与发酵线椒颜色变化有关的路径2条。(4)新鲜线椒与自然发酵第20d的线椒微生物差异表达基因共有4836个,4026个基因表达量上调,810个基因表达量下调,3079个基因表达量显著上调,361个基因表达量显著下调。筛选到3个表达量较高的差异表达基因。(5)Lactobacillus plantarum、Weissella paramesenteroides和Lactococcus lactis是线椒自然发酵过程中的3种关键微生物,可作为辣椒控制化发酵技术中的最佳复合发酵剂。