论文部分内容阅读
目的:乳腺癌是当前女性发病率最高的恶性肿瘤,其发病率呈快速上升趋势。三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer,TNBC)是指雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptors-2,Her-2)均呈阴性的一种特殊类型乳腺癌,占所有乳腺癌的10.0%~20.8%,是预后最差的一个亚型。它具有发病早、预后差、易早期复发、死亡率高、极易发生侵袭转移的特点。共刺激分子B7同源体4(B7 homolog 4,B7-H4)表达于多种恶性肿瘤,可抑制T细胞增殖和细胞因子分泌,促进肿瘤细胞周期阻滞,从而诱导肿瘤的发生发展。B7-H4表达水平与多种肿瘤患者的临床病理特征及不良预后密切相关,可能成为肿瘤免疫治疗的靶向分子。本研究通过探讨B7-H4分子与TNBC临床病理特征的关系,以及对TNBC细胞增殖、凋亡及侵袭等生物学特性的影响,分析B7-H4分子在TNBC发生及发展的分子生物学机制。方法:1利用免疫组织化学方法检测B7-H4分子在Luminal A、Luminal B、Her-2和TNBC组织中蛋白水平的表达,并分析其表达与临床病理特征及预后的关系。2构建沉默B7-H4的sh RNA表达载体,转染TNBC细胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468,同时用control-sh RNA做阴性对照,转染48h后收集细胞进行相关生物学特性方面的检测。3利用荧光显微镜和Western-blot方法检测control-sh RNA和B7-H4-sh RNA在MDA-MB-231,MDA-MB-453、MDA-MB-468细胞中的转染效率,筛选一株细胞进行后续试验。4 MTT法检测下调B7-H4分子表达后对MDA-MB-453细胞体外增殖的影响并绘制生长曲线。5利用Transwell小室实验检测下B7-H4分子表达后对MDA-MB-453细胞侵袭及迁移能力的影响。6采用流式细胞术检测下调B7-H4分子表达后对MDA-MB-453细胞凋亡情况。7利用实时荧光定量PCR和Western-blot方法检测下调B7-H4分子表达后对MDA-MB-453细胞内NF-κB信号通路中p65亚基m RNA和蛋白水平表达的影响。结果:1免疫组织化学分析结果显示在111例乳腺癌组织中,B7-H4的阳性率为73.9%(82/111),主要表达于癌细胞胞浆和胞膜。根据乳腺癌的分子表型进行分类为:Luminal A型、Luminal B型、Her-2型和三阴型,结果显示B7-H4在TNBC组织中表达的阳性率为90.2%(37/41),明显高于Luminal A型:66.7%(14/21),Luminal B型:68.0%(17/25)和Her-2型:58.3%(14/24)。B7-H4在TNBC组阳性率明显高于Luminal A型、Luminal B型、Her-2型,差异有统计学意义(P≤0.0167)。在41例TNBC组织中,B7-H4的高表达多见于浸润性导管癌型,与其他类型相比,差异具有统计学意义(P<0.05);B7-H4在淋巴结转移的TNBC患者组织中阳性表达率比率显著高于无淋巴结转移者(P<0.05);且B7-H4的表达与雄性激素受体(androgen receptor,AR)的阴性表达显著高于AR阳性患者(P<0.05)。研究未发现B7-H4的表达与TNBC患者其他临床病理特征,如年龄、TNM分期、组织学分级、Ki-67的表达存在相关性(P>0.05)。对TNBC组进行生存分析,结果显示,B7-H4阳性表达组5年无病生存率(disease free survival,DFS)为59.5%明显低于阴性组75.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。2转染效率的检测结果利用荧光显微镜观察质粒转染效果,并用Western-blot方法检测得到转染效率分别为:①MDA-MB-231细胞:control-sh RNA和B7-H4-sh RNA的B7-H4与内参灰度比值分别为0.236±0.180和0.180±0.018,B7-H4-sh RNA转染效率为23.6±0.03%(P<0.01)。②MDA-MB-453细胞:control-sh RNA和B7-H4-sh RNA的B7-H4与内参灰度比值分别为0.871±0.190和0.217±0.006,B7-H4-sh RNA转染效率为75.1±0.80%(P<0.01)。③MDA-MB-468细胞:control-sh RNA和B7-H4-sh RNA的B7-H4与内参灰度比值分别为0.691±0.018和0.358±0.061,B7-H4-sh RNA转染效率为48.2±8.00%。结果提示,MDA-MB-453细胞B7-H4蛋白高表达,且B7-H4-sh RNA对MDA-MB-453细胞的转染效率明显高于其他两株细胞,(P<0.01),因此适合进行后续生物学功能试验。3 MTT实验检测结果MTT分析结果显示,将control-sh RNA组和B7-H4-sh RNA组MDA-MB-453细胞分别接种于96孔板24h、48h、72h后,control-sh RNA组细胞检测的吸光度值分别为0.326±0.093,0.612±0.123,1.115±0.111;B7-H4-sh RNA组细胞检测的吸光度值分别为0.282±0.072,0.372±0.100,0.693±0.099。检验结果分析,接种24h后,细胞增殖无明显差异,而接种48h和72h后,B7-H4-sh RNA比control-sh RNA细胞增殖明显降低,(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。B7-H4-sh RNA在24h、48h、72h的增殖抑制率分别为12.8±4.1%、39.9±4.9%和38.0±2.8%。4细胞侵袭和迁移的检测结果倒置显微镜下观察MDA-MB-453细胞穿过Transwell小室侵袭至下室数量:control-sh RNA组和B7-H4-sh RNA组分别为(200.3±8.0)和(93.7±6.0)个/高倍视野(×100),B7-H4-sh RNA组明显少于control-sh RNA组(P<0.01);倒置显微镜下观察MDA-MB-453细胞穿过Transwell小室迁移至下室数量:control-sh RNA组和B7-H4-sh RNA组分别为(295.0±8.7)和(147.3±3.5)个/高倍视野(×100),B7-H4-sh RNA组明显少于control-sh RNA组(P<0.01),结果说明下调B7-H4的表达可抑制MDA-MB-453细胞的侵袭和迁移能力。5流式细胞术检测结果流式细胞术检测结果显示,MDA-MB-453细胞转染B7-H4-sh RNA后,细胞凋亡率与control-sh RNA组相比显著增加,50.9±4.0%的MDA-MB-453细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05)。说明通过下调B7-H4可促进TNBC细胞的凋亡,并调控细胞周期使其停滞于G0/G1期。6实时荧光定量PCR和Western-blot检测结果利用Real-time PCR方法检测p65基因在MDA-MB-453细胞m RNA水平上的表达,结果显示B7-H4-sh RNA组p65表达量明显低于control-sh RNA组,差异具有统计学意义(P<0.05),而且Spearman相关性分析结果显示p65和B7-H4 m RNA表达呈正相关(P<0.01)。利用Western-blot方法检测p65分子在MDA-MB-453细胞中蛋白的表达,结果显示B7-H4-sh RNA组p65表达量明显低于control-sh RNA组,差异具有统计学意义(P<0.05),且B7-H4与p65表达呈正相关。结论:B7-H4分子在不同乳腺癌亚型组织中均有表达,其中在TNBC中阳性表达率最高。B7-H4的表达与TNBC病理类型、淋巴结转移、AR的阴性表达及与不良预后存在相关性。下调B7-H4分子的表达后,TNBC细胞体外增殖、侵袭和迁移的能力均减弱,并诱导了细胞凋亡,同时抑制NF-κB途径主要发挥转录调节功能的亚基p65的表达。因此,B7-H4可能有望成为TNBC靶向治疗的新指标。6实时荧光定量PCR和Western-blot检测结果