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目的应用颈上神经节切除术(superior cervical ganglionectomy,SCGx)建立成年雄性大鼠失交感神经支配模型,检测SCGx术后1d、3d、7d和15d成年大鼠海马组织结构以及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、水通道蛋白9(aquaporin 9,AQP9)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-assaciated X protein,Bax)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)蛋白及m RNA的动态表达规律,探讨MMP9、AQP9、VEGF、Bax和Bcl-2参与SCGx术后大鼠海马损伤及恢复的作用机制,进而探索交感神经对大鼠海马的支配作用。方法1.构建大鼠SCGx模型及分组:125只成年雄性Wistar大鼠,分为5组:只暴露不切除SCG的对照组(Control group);双侧切除SCG后存活1d组(SCGx-1d);双侧切除SCG后存活3d组(SCGx-3d);双侧切除SCG后存活7d组(SCGx-7d);双侧切除SCG后存活15d组(SCGx-15d)。2.组织学观察:应用苏木精—伊红染色法(Hematoxylin—Eosin staining,HE)观察各组大鼠海马CA1区、CA3区和DG区神经元数目及形态变化。3.免疫阳性反应产物定位:应用免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)观察MMP9、AQP9、VEGF、Bax和Bcl-2在各组大鼠海马CA1区、CA3区和DG区免疫阳性反应产物表达位置、数量及强弱的变化。4.蛋白表达定量检测:应用蛋白质印迹法(Western-blotting,WB)检测各组大鼠海马MMP9、AQP9、VEGF、Bax和Bcl-2蛋白表达变化。5.m RNA表达定量检测:应用实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)检测各组大鼠海马MMP9、AQP9、VEGF、Bax和Bcl-2 m RNA表达变化。6.相关性分析:应用SPSS软件Pearson相关分析各组大鼠海马MMP9、AQP9、VEGF、Bax和Bcl-2在蛋白水平与m RNA水平表达量的相关性;以及大鼠海马MMP9、AQP9、VEGF、Bax和Bcl-2在颈上神经节切除后不同时间点动态变化规律的相关性。结果1.本研究通过改良的摘除颈上神经节手术法成功建立大鼠失交感神经支配模型,手术成功大鼠表现为双侧瞳孔缩小、眼球后陷、睑裂明显变窄且对光反射消失,出现“Horner综合征”。2.HE染色结果显示:SCGx-1d组大鼠海马神经元数量和形态与Control组相比无明显差异;SCGx-3d组大鼠海马出现神经元排列紊乱、部分细胞缺失或有空泡、神经元变性以及大量炎性细胞浸润;SCGx-7d组大鼠海马神经元排列较SCGx-3d组整齐,神经元变性坏死程度较SCGx-3d组明显减轻,且浸润的炎性细胞数目减少;SCGx-15d组大鼠海马存活神经元数量较SCGx-7d组明显增多且排列整齐,炎性细胞浸润现象消失。3.免疫组化结果显示:Control组大鼠海马仅有极少量MMP9、AQP9、VEGF、Bax和Bcl-2弱阳性神经元的散在分布;SCGx-1d组大鼠海马各区尤其是DG区MMP9、AQP9、VEGF和Bax阳性神经元较Control组数量增多且着色变深,但Bcl-2免疫阳性反应呈下降趋势;SCGx-3d组大鼠海马CA1区、CA3区及DG区均出现大量MMP9、AQP9、VEGF和Bax的强阳性反应产物,此外毛细血管内皮细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、脉络丛以及室管膜细胞也出现MMP9、AQP9和VEGF的免疫阳性反应着色,但此时Bcl-2免疫阳性反应降至最低;SCGx-7d组和SCGx-15d组大鼠海马MMP9、AQP9和Bax免疫阳性反应呈下降趋势,但仍高于Control组,此外,大鼠海马仍存在大量VEGF阳性神经元,Bcl-2免疫阳性反应呈回升趋势。4.WB结果显示:手术组大鼠海马MMP9、AQP9、VEGF和Bax的蛋白表达量均比对照组明显增加,而Bcl-2的蛋白表达量减少,其结果与免疫组化结果基本一致。具体比较,大鼠海马MMP9蛋白表达量由大到小依次为:SCGx-3d组(与对照组比较,P<0.01)>SCGx-7d组(P<0.01)>SCGx-15d组(P<0.01)>SCGx-1d组(P<0.05)>Control组;大鼠海马AQP9蛋白表达量由大到小依次为:SCGx-3d组(P<0.01)>SCGx-7d组(P<0.01)>SCGx-15d组(P<0.01)>SCGx-1d组(P>0.05)>Control组;大鼠海马VEGF蛋白表达量由大到小依次为:SCGx-3d组(P<0.01)>SCGx-7d组(P<0.01)=SCGx-15d组(P<0.01)>SCGx-1d组(P<0.01)>Control组;大鼠海马Bax蛋白表达量由大到小依次为:SCGx-3d组(P<0.01)>SCGx-1d组(P<0.05)>SCGx-7d组(P<0.05)>SCGx-15d组(P>0.05)>Control组;大鼠海马Bcl-2蛋白表达量由大到小依次为:Control组>SCGx-15d组(P>0.05)>SCGx-7d组(P>0.05)>SCGx-1d组(P<0.05)>SCGx-3d组(P<0.01)。5.RT-PCR结果显示:手术组大鼠海马MMP9、AQP9、VEGF和Bax的m RNA表达量均比对照组明显增加,而Bcl-2的m RNA表达量减少,其结果与WB结果基本一致。具体比较,大鼠海马MMP9 m RNA表达量由大到小依次为:SCGx-3d组(与对照组比较,P<0.01)>SCGx-7d组(P<0.01)>SCGx-15d组(P<0.01)>SCGx-1d组(P<0.05)>Control组;大鼠海马AQP9 m RNA表达量由大到小依次为:SCGx-3d组(P<0.01)>SCGx-7d组(P<0.05)>SCGx-15d组(P<0.05)>SCGx-1d组(P>0.05)>Control组;大鼠海马VEGF m RNA表达量由大到小依次为:SCGx-15d组(P<0.01)>SCGx-7d组(P<0.01)>SCGx-3d组(P<0.01)>SCGx-1d组(P>0.05)>Control组;大鼠海马Bax m RNA表达量由大到小依次为:SCGx-3d组(P<0.01)>SCGx-1d组(P<0.05)>SCGx-7d组(P<0.01)>SCGx-15d组(P<0.05)>Control组;大鼠海马Bcl-2蛋白表达量由大到小依次为:SCGx-15d组(P>0.05)>Control组>SCGx-1d组(P>0.05)>SCGx-7d组(P>0.05)>SCGx-3d组(P<0.01)。6.相关性分析显示:各组大鼠海马的MMP9、AQP9、VEGF、Bax和Bcl-2蛋白水平与其对应m RNA水平表达均呈正相关;MMP9、AQP9、VEGF和Bax之间的两两相关性分析结果表明,大鼠海马MMP9、AQP9和Bax在颈上神经节切除后不同时间点的蛋白和m RNA表达的动态变化规律呈正相关;Bax和Bcl-2在颈上神经节切除后不同时间点的蛋白和m RNA表达的动态变化规律呈负相关。结论1.经成年大鼠改良的摘除颈上神经节可以建立起稳定、可靠的失交感神经支配实验动物模型。2.在SCGx所致大鼠失交感神经支配模型中,MMP9和AQP9蛋白及m RNA表达呈现先上调后下降的动态变化,提示MMP9和AQP9可能参与了细胞外基质降解、血脑屏障破坏及脑水肿的病理过程。3.在SCGx所致大鼠失交感神经支配模型中,VEGF蛋白及m RNA表达呈现上调并持续高表达,提示VEGF可能在SCGx后发挥神经元保护和血管新生作用。4.在SCGx所致大鼠失交感神经支配模型中,Bcl-2/Bax蛋白及m RNA呈现先下降后回升趋势,提示Bax和Bcl-2参与由SCGx所致的海马神经元失巢凋亡。