论文部分内容阅读
前言细胞凋亡是氨基糖甙类抗生素(AmAn)引起毛细胞死亡的主要方式，但其分子学机制还不确切。已经证明在耳毒性药物所致的毛细胞损害中有氧自由基的产生。一些学者还发现在凋亡的毛细胞中有c-jun氨基末端激酶(JNK，一种能促使不同组织细胞凋亡的应激活化蛋白激酶)的活化。在其它组织中已经证明自由基(ROS)可以活化JNK。为此，本实验以庆大霉素(GM)造成大鼠耳蜗损伤的动物模型，观察还原型谷胱甘肽(GSH)对毛细胞凋亡和JNK活化的影响。结果显示：AmAn致耳蜗毛细胞损伤是通过凋亡实现的，其可能模式为：自由基的产生→JNK的活化→细胞凋亡。材料与方法一、实验材料(一)实验动物选取耳廓反射灵敏、耳声发射测试正常的健康Wistar大鼠40只，体重250g—350g，雌雄不限。(二)主要试剂及仪器庆大霉素注射液、还原型谷胱甘肽注射液、TUNEL检测试剂盒、p-JNK抗体、耳声发射仪、扫描电镜、正立显微镜。二、实验方法将所选取的40只Wistar大鼠随机分为4组，每组10只：正常对照组每日1次肌注生理盐水；GM组每日1次GM 120mg／kg肌注；GSH组每日1次GSH400mg／kg肌注；GM+GSH组每日先肌注GSH 400mg／kg，4小时后再肌注GM120mg／kg；连续给药10天。在给药的前1天及最后给药的次日测试动物的畸变耳声发射(DPOAE)。在第2次测DPOAE后，将动物断头处死，取出听泡，暴露耳蜗。左耳用2.5％戊二醛固定，行扫描电镜观察。右耳用4％多聚甲醛固定，制作10μm厚冰冻切片。单号片行TUNEL检测，双号片行p-JNK免疫组化染色，光镜下观察结果。用t检验和费歇尔精确概率法检验进行统计学分析。实验结果给药10天后，GM组大鼠的DPOAE幅值明显下降(p＜0.01)，扫描电镜观察静纤毛粘连、散乱、倒伏，TUNEL和JNK阳性染色明显；GSH组大鼠的DPOAE幅值无明显变化，扫描电镜观察毛细胞形态和静纤毛正常，TUNEL和JNK染色阴性；两药合用组大鼠的DPOAE幅值高频处下降(4、6、8KHz)，但轻于GM组(p＜0.01)，扫描电镜观察静纤毛粘连、散乱、倒伏也轻于GM组，TUNEL和JNK阳性染色少于GM组(p＜0.01)，毛细胞的形态和功能受到明显保护。讨论本实验以庆大霉素造成大鼠耳蜗的损伤，以还原型谷胱甘肽为保护剂，观察了其对庆大霉素所致的毛细胞凋亡和磷酸化JNK表达的影响。近年来，许多实验研究证明AmAn所致的内耳损伤主要是通过毛细胞凋亡实现的。细胞凋亡，是细胞在基因控制下的自身主动死亡的过程，是细胞对不引起细胞立即死亡剂量的毒性刺激所做出的反应。是由一系列的转译后的蛋白活化引起的，涉及细胞内的信号传导通路。许多学者观察到凋亡的毛细胞中JNK通路被活化，同时JNK的抑制剂可以明显减轻AmAn所致的耳蜗和前庭毛细胞的损伤。已经证明在其它组织中自由基可以活化JNK，检测暴露于耳毒性药物后的内耳组织发现大量的自由基，说明JNK的活化可能受自由基的调节。由此推断，AmAn致毛细胞损伤的模式可能为：自由基的产生→JNK的活化→细胞凋亡。结论1、庆大霉素致大鼠耳蜗毛细胞损伤主要是通过凋亡实现的；2、JNK参与了庆大霉素致大鼠耳蜗毛细胞凋亡的调控过程；3、通过还原型谷胱甘肽对庆大霉素致大鼠耳蜗毛细胞凋亡中JNK磷酸化表达的影响，间接证明了自由基参与活化JNK通路。AmAn致耳蜗毛细胞损伤可能是通过自由基的产生导致JNK的活化，最后导致毛细胞凋亡。