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为了分析验证phaA、phaB和phaC三个基因的生物学功能，本实验采用PCR技术，从合成PHA的pseudomanas sp．菌株的亚克隆基因组片段中，分离出phaA、phaB和phaC三个基因片段，定向克隆至原核表达载体pBV220上，构建了三个原核生物表达载体pBV-A、pBV-B和pBV-C，通过对表达载体诱导表达，表达蛋白产物的SDS-PAGE分析、生物活性与功能分析，确定了基因phaA、phaB和phaC的生物学功能。结果表明： 1．利用所提取的开放阅读框架的序列设计三对引物，采用PCR技术，从合成PHA的亚克隆片段中分离出phaA、phaB和phaC三个基因片段，经凝胶电泳分析表明，所克隆的三个基因分子量大小与推测的三个开放阅读框架中基因片段大小一致。 2．将phaA、phaB和phaC片段双酶切后，定向克隆至原核表达载体pBV220，构建了三个原核表达载体pBV-A、pBV-B和pBV-C；经酶切分析表明，所克隆的三个基因phaA、phaB和phaC置于表达载体的正确阅读框架下。 3．利用温度诱导外源基因的表达，发现诱导后2小时外源基因开始表达，所表达蛋白的量随着时间的增加而增加，当诱导时间为4小时后外源基因表达的增加量趋于平稳，确定4小时为较为合适的诱导时间。 4．表达载体pBV-A、pBV-B和pBV-C经诱导表达，发现所表达的蛋白均为可溶性蛋白，没有包涵体出现；蛋白经SDS—PAGE分析表明，基因phaA表达的蛋白分子量为42kDa，与β—酮硫裂解酶分子量大小一致；基因phaB表达的蛋白分子量为26kDa，与乙酰乙酰CoA还原酶分子量大小一致；基因phaC表达的蛋白分子量为63kDa，与PHA合成酶分子量大小一致。 5．将phaA、phaB和phaC基因表达的蛋白产物混和后，加入底物乙酰CoA，于230nm—240nm波长下，对反应产物进行扫描，发现在波长235nm处有明显的PHA特异吸收峰；表明混和物中有PHA的产生，所表达的蛋白具有生物学活性和特定功能，证实所克隆的phaA、phaB和phaC就是合成PHA所需的三个基因。