急性脑梗死(ACI)是导致病损严重、致残率高和神经功能恢复困难的重要原因。我们既往研究发现RhoA抑制信号通路参与ACI病变过程并阻遏内源性神经干细胞(eNSCs)增殖与分化,电针百会、大椎穴可抑制RhoA信号跨膜传导,减轻丘脑、黑质、海马继发损害。但电针减轻ACI损害与PRG5调控RhoA抑制信号跨膜传导、促进神经再生等关键问题不清楚。本课题建立大脑中动脉阻断(MCAO)模型：①动态观察电针对梗死灶神经纤维、丝状伪足和轴突生长及神经修复影响。②用shRNA介导沉默PR05基因,检测神经干细胞发生部位海马处BrdU/Nestin、BrdU/DCX、BrdU/NeuN、 BrdU/GFAP的表达,明确PRG5抑制RhoA通路及电针作用。③检测eNSCs分化相关RhoA信号通路蛋白,明确电针调控PRG5/RhoA促进eNSCs分化机制；明确电针介导PRG5调控RhoA通路促进eNSCs增殖为治疗新靶点,为电针减轻ACI损害提供新的理论依据。目的：通过观察电针对大脑中动脉阻塞模型大鼠脑组织形态学、神经功能缺损评分、海马区eNSCs增殖与分化表达的影响,明确电针阻遏中枢神经抑制信号传导通路对海马尤其是齿状回部位eNSCs影响,探讨电针对抗脑缺血损伤和促进神经修复的分子机制,探讨电针促进神经功能修复和对抗脑缺血损伤的分子机制,为电针减轻ACI后神经功能损害与促进eNscs增殖、分化的研究提供新的分子靶标,为指导临床运用电针治疗脑梗塞提供理论依据。方法：雄性健康SD大鼠160只,鼠龄为10-12周龄,体重220-250g,适应环境饲养3天后开始实验。模型组(MCAO)分为脑缺血模型组和敲低PRG5脑缺血模型组(ShPRG5 +MCAO)、电针组(EA)分为模型电针组和敲低PRG5电针组(ShPRG5+EA);每组30只,再分为1d、7d、14d三个时间点,每组每个时间点取10只行取材处理。随机抽取6只大鼠采用免疫荧光法检测各组大鼠梗死灶BrdU/Nestin(确定内源性eNSCs标记)、BrdU/DCX(确定eNSCs增殖)、BrdU/NeuN(确定eNSCs分化为神经元)、BrdU/GFAP(确定eNSCs分化为星形胶质细胞)的表达情况；随机抽取6只大鼠采用Western blot法检测梗死灶PRG5、LPA、NogoA、RhoA蛋白的情况表达。结果：1.大脑中动脉阻塞模型大鼠造模成功后,各组其神经功能缺损评分在1d后最为明显,随着时间的延长其功能评分和症状逐渐改善。在行电针治疗后,TTC染色结果提示,大脑中动脉阻塞模型大鼠脑组织TTC染色显示神经功能缺损改变与梗死灶变化改变基本一致。MCAO大鼠造模成功的大鼠会明显反应迟钝,体重减轻,进食减少,精神差,嗜睡。向上提鼠尾时左前肢内收,MCAO大鼠朝前爬行向左侧倾倒或左侧转圈,甚至完全不能行走,意识水平下降,某些大鼠可出现左侧霍纳氏征等神经功能缺损症状。少部分大鼠出现眼结膜、鼻粘膜分泌物增多,严重的出现抽搐或死亡。假手术组(Shame)在MCAO术后1d、7d、14d三个时间点神经功能缺损评分均为0分。造模成功后,MCAO组大鼠神经功能缺损评分1d后达到高峰,随后开始降低。电针治疗组(EA)大鼠神经功能缺损评分1d后神经功能缺损评分最高,随后开始降低,7d接近或稍高于正常水平。MCAO组与EA治疗组大鼠在MCAO术后1d、7d、14d三个时间点比较,均有统计学差异(P<0.05)；EA治疗组、MCAO组与shame组在造模后1d、7d、14d三个时间点比较均有统计学意义(P<0.05)。2.尼氏染色结果显示,每高倍镜视野(HP)下,Shame组大鼠海马CA1、CA3区异染色质少；MCAO组大鼠海马区出现尼氏小体颗粒减少或消失,出现大量的空泡,胞体肿胀；MCAO组锥体细胞层次不清、排列紊乱, 神经细胞肿胀、 核仁不清, 伴空泡变性,大鼠海马CA1、A3区神经元及胶质细胞严重皱缩深染。EA组海马CA1、CA3区神经元细胞核、核仁较MCAO组清晰,存活神经元数目也多于MCAO组(P<0.05)。3.EA-7d组和MCAO-7d组损伤侧海马处均出现红色Brdu日性细胞,主要集中在CA1、CA3、DG, Brdu阳性细胞呈卵圆形或圆形,成簇分布,着色深。Shame-7d组和MCAO-7d组损伤侧海马可见Brdu阳性细胞分散于海马齿状回,两组数量无明显差别(P>0.05); EA-7d组和MCAO-7d组海马处均可见Brud阳性细胞,但EA-7d组Brdu阳性细胞的数量较MCAO-7d组多,差别有统计学意义(P>0.05)；14天组中MCAO-14d组损伤侧海马Brdu阳性细胞较shame-14d组明显减少；EA-14d损伤侧海马的Brdu阳性细胞虽然较EA-7d有所减少,但明显较 MCAO-14多(P>0.05)。本实验第1d后,海马梗死侧DG区BrdU/Nestin双标阳性表达增加,7d时表达至高峰,且明显高于shame组大鼠(P>0.05)；14d时阳性表达下降,但仍高于shame组(P>0.05)。shame组齿状回内见少量BrdU/DCX+细胞。DCX免疫组化阳性细胞主要位于缺血DG区。EA组较MCAO组7d、14d差异有显著性意义(P<0.05)。MCAO组大鼠脑梗死后第7d达到峰值；随后阳性表达减弱,电针组大鼠BrdU/NeuN阳性表达均明显高于MCAO组及shame组(P>0.05)。与shame相比MCAO组和EA组海马区GFAP免疫阳性细胞均较shame增多,两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。EA组海马区GFAP免疫阳性细胞较ShPRG5+EA组与EA组在术后1d即可见Brdu/nestin的阳性细胞表达升高,并逐渐上升,在第7d处于最高值,随后开始下降。ShPRG5+EA组与EA组大鼠在脑缺血后1d、7d、14d时间点比较,均有统计学差异(P<0.05)；EA组与shame组在脑缺血后1d、7d、14d时间点比较均有统计学意义(P<0.01)；shame组、EA组、敲低PRG5后电针组均可见少量神经元前体细胞,在脑缺血1d后即可增加,7d后细胞数逐渐减少,Sham组有少量表达。EA组与ShPRG5+EA组神经元前体细胞数量差异有统计学意义(P<0.05)。3个时间点电针组大鼠BrdU/NeuN阳性表达均明显高于ShPRG5+EA组。EA组与ShPRG5+EA组在脑出血后1d即可见Brdu/GFAP表达升高,并逐渐上升,在第7d处于最高值,随后开始下降,第14d后ShPRG5+EA组仍高于同期各组。EA组与ShPRG5+EA组大鼠在脑缺血后第7d、14d后比较,均有统计学差异(P<0.05)；与假手术组相比,在脑缺血后1d、7d比较均有统计学意义(P<0.05)；与EA组相比,ShPRG5+EA组在脑缺血后1d、7d、14d三个时间点均升高。4.与shame组比较,敲低PRG5组大鼠各时间点PRG5 mRNA的表达显著减少,说明敲低后可使MCAO大鼠脑内PRG5 mRNA的表达下调。与敲低MCAO组比较,EA组各时间点PRG5 mRNA的表达增加(P<0.01),具有统计学意义,表明电针后可使PRG5 mRNA的表达上调。：与shame组相比,7d和14dMCA0组大鼠RhoA蛋白的表达显著增加(P<0.05),说明脑缺血后可促进大鼠RhoA蛋白的表达,与MCAO组比较,EA组RhoA蛋白的表达减少,具有统计学意义(P<0.05),电针可使RhoA蛋白的表达下调。与MCAO组比较,ShPRG5+MCAO组的RhoA蛋白的表达各时间点上调明显,具有显著性差异(P<0.05)；与ShPRG5+M组相比,ShPRG5+EA组RhoA蛋白表达增加,具有显著性差异(P<0.05)。MCAO组中7d和14d大鼠海马RhoA蛋白表达与Shame组相比均显著上升(P<0.05)。在MCAO术后7d和14d中,各电针干预组表达较MCAO组降低(P<O.05),其中敲低PRG5组的RhoA蛋白表达较未敲低组相比各时间点均升高,有显著差异(P<0.05),同时与敲低PRG5组后电针干预组相比各时间点均升高,有统计学意义(P<0.05)。与shame组相比,MCAO组大鼠NogoA蛋白的表达显著增加(P<0.05),说明造模后可促进模型大鼠脑内NogoA蛋白的表达,电针可使NogoA蛋白的表达下调。与MCAO组比,各时间点EA组的NogoA蛋白的表达减少(P<0.05),具有统计学意义。与MCAO组比较,ShPRG5+M组的NogoA蛋白的表达各时间点上调明显,具有显著性差异(P<0.05)；与EA组相比,ShPRG5+EA组NogoA蛋白表达增加,具有统计学意义(P<0.05)。MCAO组与shame组3个时间点比较,海马部位的LPA蛋白表达均有所升高(P<0.05)；EA组与shame组比较,海马部位的LPA蛋白表达1d后开始升高,7d达到峰值,14d蛋白表达下降(P<0.05),与MCAO组比较,ShPRG5+M组海马部位LPA蛋白的表达有所升高,海马部位的LPA蛋白表达量明显上升(P<0.05),与(P<0.05)；与ShPRG5+EA组相比较,EA组海马部位的LPA蛋白表达量略有降低,敲低PRG5后LPA蛋白表达上升,具有显著性差异(P<0.05)。Shame组三个时间点之间无显著性差异(P>0.05)；MCAO组中1 d组与7d组、14d与7d组之间均有统计学差异(P<O.05),而14d组与1d组之间的差异不明显(P>0.05)；与shame组相比,同时间点未敲低各组均明显高于同时段的shame组(P<0.05)。EA组中1d组与7d、14d组之间均有显著差异(P<0.05),而7d组与14d组之间的差异不显著均无统计学意义(P>0.05)。与shame组相比,1d组与14d组差异不显著(P>0.05),其余未敲低1d组、7d组、14d组均高于同时间点的shame组(P<0.05)；与MCAO组相比较,1 d后EA组与MCAO组之间差异不显著(P>0.05),7d组的EA组与MCAO组之间的差异显著(P<0.05)。ShPRG5+M组中d组与7d组、14d组之间无显著的差异(P>0.05)。与shame组相比较,1d组、7d组、14d组各均低于同时相的shame组(P<0.05)；与MCAO组相比,3个时间点的组别之间的差异均有统计学意义(P<0.05)；与EA组相比较,各时间点组别之间均有显著的差异(P<0.05)。ShPRG5+EA组中1d组与7d组之间有显著的差异(P<0.05)。与shame组相比,7d组、14d组均高于同时相下的shame组(P<0.05)；与MCAO组相比,1d组之间有显著的差异(P<0.05),其余2个时间点与MCAO组的比较无统计学意义(P>0.05)。与EA组相比较,3个时间点的组别之间的有显著的差异(P<0.05)；与ShPRG5+M组相比,1d组与7d组之间有显著的差异(P<0.05),1d组与14d组的比较均无显著差异(P>0.05)。结论：1.电针可改善MCAO大鼠神经功能及脑梗死体积比,可能与抑制RhoA信号通路、促进eNSCs增殖与分化有关。2.电针对梗死灶通路蛋白Nestin(确定内源性eNSCs标记)、BrdU/DCX(确定eNSCs增殖)、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP((确定eNSCs分化)阳性细胞数增加,电针可促进MCAO大鼠海马部位eNSCs增殖、分化。3. 电针百会、大椎穴可促进PRG5的表达从而抑制MCAO模型大鼠梗死灶RhoA信号通路上LPA、NogoA、RhoA的表达,PRG5是通过抑制RhoA信号通路并诱导轴突生长和促进eNSCs增殖分化,从而起到促进神经再生的作用,且存在时间依赖性。