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河蚬(Corbicula fluminea)不仅营养丰富,含有大量的蛋白质、糖原、氨基酸、牛磺酸、多种维生素和微量元素等,同时还具备食用价值、保健作用以及药用功效,自古就有关于河蚬作为护肝中药材的记载。本文以台湾河蚬干粉为原料,其蛋白质含量高达56.59±0.50%,采用多种蛋白酶对其进行水解获得其酶解产物,经活性筛选、分离纯化和结构鉴定等过程,确定河蚬多肽的氨基酸序列,并进一步测定了河蚬多肽对乙醇诱导LO2细胞损伤的保护作用。选用5种蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶和复合风味蛋白酶)分别水解河蚬蛋白,得到河蚬的不同酶解物。DPPH自由基清除实验表明,河蚬不同酶解物均具备一定的DPPH自由基清除能力。ORAC实验显示,胰酶和复合风味蛋白酶的河蚬酶解物ORAC值分别为2.54±0.18和2.59±0.06 mmol Trolox/g,显著高于其他酶解物。MTT实验和谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性测定实验结果显示,在乙醇浓度为0.8 mol/L时,细胞存活率下降到53.49±5.33%,同时培养液中ALT和AST的活性也显著高于空白组,证明乙醇诱导LO2细胞损伤模型建立成功。利用该细胞模型评价河蚬酶解物的护肝活性,发现与模型组相比,河蚬酶解物能使LO2细胞的存活率显著升高,其中由胰酶和复合风味蛋白酶制备的河蚬酶解物效果最优,且两者均可抑制乙醇导致的LO2细胞中ALT和AST的分泌,减缓乙醇对LO2细胞的损伤。对河蚬的胰酶酶解物PCH和复合风味蛋白酶酶解物FCH进一步研究,其中氨基酸组成分析结果表明,PCH和FCH中含有17种氨基酸,其中必需氨基酸分别占总氨基酸的38.67%和37.90%,具有抗氧化能力的氨基酸分别占总氨基酸的75.69%和75.06%。HPLC法测定PCH和FCH的分子量分布结果显示,分子量小于1000Da的多肽占比分别为53.37%和86.93%。PCH和FCH经过Sephadex G-15分离纯化后,选择ORAC活性最优的组分进行UPLC-MS/MS实验。分析二级质谱图,共鉴定出6条河蚬多肽,其氨基酸序列分别为:RRKC(RC-4)、DAPF(DF-4)、LVYP(LP-4)、MASR(MR-4)、ELY(EY-3)和YFLP(YP-4)。采用标准Fomc方案的固相合成方法获得河蚬多肽MR-4、YP-4、DF-4、EY-3、LP-4和RC-4,纯度均在99%以上。河蚬多肽MR-4、YP-4、EY-3和LP-4的ORAC值均显著高于GSH,其中河蚬多肽YP-4和LP-4的ORAC值分别为2.25±0.07和2.18±0.28 mol Trolox/mol,显著高于其他河蚬多肽。在一定浓度范围内,河蚬多肽对LO2细胞的增殖均没有显著性影响。河蚬多肽MR-4、YP-4、DF-4、EY-3和LP-4均可以抑制乙醇对LO2细胞的毒性,其中河蚬多肽YP-4和LP-4对乙醇诱导LO2细胞损伤的保护作用显著优于其他多肽,Amnis成像流式检测二者均可抑制乙醇诱导LO2细胞线粒体膜电位(Δψm)下降,减缓乙醇对线粒体功能紊乱造成的影响。同时,河蚬多肽YP-4和LP-4均可以降低乙醇诱导下LO2细胞内的活性氧簇(ROS)水平。进而验证了其对乙醇诱导LO2损伤具有很好的保护作用。