塔格糖是一种稀少糖,果糖的差向异构体。甜味与蔗糖相似,但热量为蔗糖的三分之一,所以被称为低热量甜味剂。塔格糖具有低热量、无龋齿性、益生元作用和抗氧化活性等优良的营养特性。目前塔格糖的常规生物合成是利用酶法通过半乳糖异构化而生产,其缺点为底物昂贵。针对塔格糖的绿色生物合成,已设计开发利用淀粉或麦芽糊精作为底物的酶法合成新途径,建立原子经济性更强、热动力学驱动转化效率高的新技术路线。此路径最后一步为利用塔格糖6-磷酸脱磷酶催化塔格糖6-磷酸不可逆的脱磷,产生D-塔格糖和无机磷,对于整个途径的进行具有至关重要的作用。为了探究适用于D-塔格糖工业生产的具有高酶活、高特异性、高稳定性的塔格糖6-磷酸脱磷酶,本论文主要进行了两方面的工作,一是对实验室前期挖掘的磷酸酶进行蛋白质工程改造,二是进行了潜在磷酸酶的挖掘。首先对来源于Archaeoglobus fulgidus的塔格糖6-磷酸脱磷酶（Af T6PP）进行酶活的改造,通过晶体结构解析、分子对接以及分子动力学模拟对Af T6PP进行理性设计和定点饱和突变,为了对理性设计得到的突变体及饱和突变体库进行酶活筛选,建立塔格糖6-磷酸高通量筛选方法,遗憾的是并没有获得酶活提高的突变体。潜在磷酸酶的挖掘,利用Af T6PP作为模板,建立系统发育树和序列相似性网络。通过亲缘关系和序列相似性挖掘潜在的塔格糖6-磷酸脱磷酶,最终结果表明来源于Methanothermobacter marburgensis的氨基酸序列具有塔格糖6-磷酸脱磷酶活性（Mm T6PP）,对其酶学性质的表征发现其具有应用于D-塔格糖体外合成路径中的潜力。随后,以5 g/L异淀粉酶处理过的麦芽糊精作为底物,利用终浓度为1 U/m L的TmαGP、Tk PGM、Ttc PGI、Ca TPE和Mm T6PP进行D-塔格糖体外多酶体系的概念实验,最后得到了1.88 g/L的D-塔格糖,转化率为37.5%,证明Mm T6PP可以被用于D-塔格糖体外合成路径中。本文成功建立了塔格糖6-磷酸高通量筛选方法,为塔格糖6-磷酸酶的改造奠定了基础,成功挖掘到了来源于M.marburgensis的塔格糖6-磷酸脱磷酶,并证明了其可以用于D-塔格糖体外合成路径中。