肝纤维化（hepatic fibrosis, HF）是多种病因引起的慢性肝病的共同病理过程，主要特征为细胞外基质（主要为胶原）的过度沉积，进而可发展成为肝硬化、肝癌等终末期肝病。全球每年约有140万人死于慢性肝病，已经严重威胁人类健康。迄今为止，针对肝纤维化的治疗，已经从其发生发展机制的多个环节进行了长期大量的研究，并研发了许多抗肝纤维化药物；但由于这些药物特异性差、副作用大，目前临床上仍然缺乏理想的抗肝纤维化药物。因此，研究探索有效且副作用小的肝纤维化治疗药物迫在眉睫。靶向药物由于仅作用于引起疾病的关键细胞，具有副作用小、特异性强和疗效高的特点，已经成为近年来诸多疾病治疗的新方法。　　肝纤维化形成的核心环节是肝星状细胞的活化。正常生理状态下肝星状细胞呈静止状态，当肝脏受到炎症或机械刺激时，肝星状细胞在各种致纤维化因子的作用下活化。活化的肝星状细胞一方面能够分泌胶原，另一方面能够抑制基质金属蛋白酶（主要功能为降解胶原）活化，导致胶原降解减少。胶原过度分泌和降解减少导致其在细胞外过度沉积，从而导致肝纤维化形成。因此，寻找特异性作用于肝星状细胞的靶向药物，抑制其活化或诱导其凋亡将能够有效抑制肝纤维化的形成，从而达到治疗目的。　　靶向药物的原理是应用可特异性进入特定致病细胞的载体，将药物或因子导入细胞内部，从而达到治疗效果，由于仅作用于致病细胞，因此疗效确切、副作用小。特异性载体种类繁多，其中细胞穿透肽（Cell-penetrating Peptides, CPP）转导效率高、毒性低，已经受到广泛关注。CPP是一类大小约5-30个氨基酸组成的阳离子短肽。能够携带多种不同大小和性质的物质，如多肽、蛋白质、核酸、纳米颗粒、病毒颗粒及药物等穿过细胞膜进入细胞，导致完整载物内化。CPP的这种特性为生物大分子和药物进入细胞内部提供了有力的运载工具。CPP分为非组织特异性和组织细胞特异性肽。组织细胞特异性穿透肽能够携带目的基因到达特异性靶细胞，使其在靶部位保持较高的浓度，从而收到良好的疗效，并把不良反应降到最低。目前特异性的细胞穿透肽主要通过噬菌体展示、质粒展示、微生物表面呈现技术等多肽库筛选获得。噬菌体展示技术的原理是在噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置克隆入蛋白质或多肽的目的基因或编码基因片段，使外壳蛋白与外源蛋白或多肽融合表达，在噬菌体表面展示以利于靶分子的识别和结合。洗脱下与固相上的靶蛋白的噬菌体，感染宿主细胞后经繁殖扩增及进一步洗脱得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。　　本研究旨在通过噬菌体展示技术筛选一种肝星状细胞特异性CPP并进行验证，合成其与前凋亡肽（KLA肽）的嵌合体，使其携带KLA肽进入肝星状细胞内，观察其诱导肝星状细胞凋亡的作用，为肝纤维化的治疗提供新的手段。本论文分为以下三个部分：　　第一部分：大鼠肝星状细胞特异性细胞穿透肽的筛选及验证　　目的：通过噬菌体展示技术体外筛选大鼠肝星状细胞（HSC-T6）特异性的细胞穿透肽并验证其穿透性及特异性。　　方法：从噬菌体展示随机十二肽库和环七肽库中筛选对大鼠肝星状细胞HSC-T6具有特异性穿透能力的噬菌体肽。用荧光标签FITC标记HTP（FITC-HTP），用不同浓度的FITC-HTP孵育大鼠肝星状细胞HSC-T6，检测细胞中的荧光情况。以FITC标记的TAT（FITC-TAT,一种非组织细胞特异性的穿透肽，可穿透进入多种细胞）为阳性对照，以FITC标记的KLA（FITC-KLA，一种不能穿透细胞膜的多肽）为阴性对照，观察其在多种不同种属，不同器官来源的细胞中内的穿透性。　　结果：　　1.大鼠肝星状细胞特异性穿透肽的筛选　　经过三轮筛选，测定结果显示随着筛选轮数的增加，平皿上蓝斑数量逐轮递增。表明随着筛选轮数的增加，能够穿透HSC-T6的噬菌体逐轮递增，每一轮回收率逐渐升高，初步筛选出目标噬菌体。经测序结果对比分析显示，共有两条能够内化进入HSC-T6的七肽序列，分别为GPTAKYI和VPSKPGL。其中GPTAKYI序列随着筛选轮数增加，富集现象更加明显。因此我们选择GPTAKYI作为HSC-T6优势肽作为下一步研究，命名为HTP，其对应的核苷酸序列为GGT CCG ACT GCG AAG TAT ATT。　　2.HTP可穿透进入大鼠肝星状细胞　　用不同浓度的FITC-HTP孵育大鼠肝星状细胞HSC-T6，检测细胞中的荧光情况。结果显示，50μM FITC-HTP处理的HSC-T6中即可发现荧光，并且随着孵育浓度的逐渐升高，细胞内荧光逐渐增强，表明HTP可穿透并进入HSC-T6。　　3.HTP具有细胞特异性　　FITC-TAT孵育后，在检测的7种细胞，HSC-T6（大鼠肝星状细胞）、LX-2（人肝星状细胞）、RH35（大鼠肝癌细胞）、ECV304（人脐静脉血管内皮细胞）、HEK-293（人胚肾细胞）、HepG2（人肝癌细胞）及QSG-7701（人正常肝细胞）中，均可观察到明显的荧光；FITC-KLA孵育后，7种细胞内仅显示很极少微弱的绿色荧光；而FITC-HTP孵育后，仅在HSC-T6细胞内观察到明显的绿色荧光，而其它6种细胞内几乎观察不到绿色荧光信号，表明HTP具有细胞特异性，只能特异性穿透进入大鼠肝星状细胞HSC-T6。　　结论：利用噬菌体展示技术成功筛选到特异性进入大鼠肝星状细胞HSC-T6的穿透肽HTP，其穿透性及特异性良好。　　第二部分：肝星状细胞特异性细胞穿透肽与前凋亡肽的合成及功能鉴定　　目的：合成HSC-T6特异性的穿透肽HTP与前凋亡肽的嵌合体，以HTP为载体，将KLA带入HSC-T6并鉴定其诱导凋亡功能。　　方法：合成HSC-T6特异性的穿透肽HTP与KLA肽（前凋亡肽）的嵌合体，命名为HTPK25，以HTP为载体，将KLA带入HSC-T6。以HTP为阳性对照，以KLA肽为阴性对照，用荧光标记FITC进行标记，用激光共聚焦显微镜进行观察，评估嵌合体HTPK25是否能够进入HSC-T6。TUNEL染色及检测凋亡标志蛋白 caspase-3的活性形式cleaved-caspase-3的水平，观察嵌合体HTPK25处理HSC-T6后，细胞的凋亡情况。　　结果：　　1.HTP与前凋亡肽嵌合体HTPK25的合成及穿透性检测　　结果显示，加入FITC-HTP及FITC-HTPK25的HSC-T6细胞内可观察到明显绿色荧光，随着剂量增加，绿色荧光信号增强。加入小剂量FITC-KLA的HSC-T6细胞内未见绿色荧光显示。随着剂量增加，可见极少微弱的绿色荧光信号。表明HTP不仅自身能够进入HSC-T6细胞，而且能够携带KLA肽进入HSC-T6细胞，并且随着剂量增加，荧光信号逐渐增强。而KLA肽本身不能够进入HSC-T6细胞内部。　　2.HTPK25在HSC-T6细胞中的凋亡诱导功能验证　　HTPK25孵育HSC-T6后凋亡细胞显著高于单纯穿透肽HTP孵育的细胞。表明HTPK25可诱导HSC-T6凋亡。并且与单纯穿透肽HTP孵育的细胞相比，HTPK25处理的HSC-T6中，cleaved-caspase-3的水平明显升高，表明HTP可携带KLA肽进入HSC-T6，诱导其凋亡。　　结论：成功构建大鼠肝星状细胞HSC-T6特异性细胞穿透肽HTP与前凋亡肽的嵌合体HTPK2。HTP可携带功能肽KLA进入大鼠肝星状细胞HSC-T6，并诱导其凋亡。　　第三部分：肝星状细胞特异性细胞穿透肽HTP携带前凋亡肽诱导肝星状细胞凋亡抑制其活化　　目的：明确肝星状细胞特异性细胞穿透肽HTP与前凋亡肽嵌合体HTPK25对HSC-T6的作用。　　方法：通过使用TUNEL凋亡检测试剂盒和流式细胞术两种方法检测不同剂量的HTPK25孵育24小时及同一剂量HTPK25处理HSC-T6不同时间的凋亡情况。用CCK-8试验检测细胞活力，用线粒体染料MitoTracker? Red CMXRos染色，显示线粒体形态结构，并用共聚焦显微镜进行观察。用Real-time PCR及Western blotting检测HSC活化指标α-SMA及I型胶原collagen I的mRNA及蛋白水平。　　结果：　　1.HTPK25以时间及剂量依赖方式诱导HSC-T6凋亡　　流式细胞检测结果显示流式细胞检测结果显示HTPK25感染HSC-T60,6,12,24小时，Annexin V/FITC染色阳性的肝星状细胞逐渐增多。同样， TUNEL检测结果显示随着HTPK25感染HSC-T6的时间延长，TUNEL染色阳性的肝星状细胞也增多，呈时间依赖性。结果表明HTPK25能够以时间依赖的方式诱导大鼠肝星状细胞凋亡。　　另外，不同剂量（10μM,20μM,30μM,40μM）的HTPK25孵育HSC-T624小时，流式细胞检测结果显示随着HTPK25剂量的增加， Annexin V/FITC染色阳性的肝星状细胞逐渐增多，呈剂量依赖性。同样，TUNEL检测结果显示随着HTPK25剂量的增加，TUNEL染色阳性的肝星状细胞逐渐增多，也呈剂量依赖性。以上结果表明HTPK25能够以剂量和时间依赖方式诱导大鼠肝星状细胞凋亡。　　2.HTPK25抑制HSC-T6细胞活力　　HTPK25能够导致HSC-T6细胞活力下降，随着剂量增加，HSC-T6细胞活力下降明显，呈剂量依赖关系。而HTP不能够引起HSC-T6细胞活力下降，并且细胞活力不随剂量增加而改变。HTPK25对HSC-T6细胞的半数致死量为35μM。　　3.HTPK25可引起HSC-T6细胞线粒体形态改变　　线粒体标记为红色荧光， HTP处理后，线粒体结构保持完整，而HTPK25孵育后，红色荧光部分为小点状。且与HTP组相比，HTPK25组蓝染的细胞核浓缩，减小。表明HTPK25能够导致HSC-T6细胞线粒体破坏，细胞核浓缩，HTPK25可能通过破坏线粒体结构，导致细胞凋亡。　　4.HTPK25抑制HSC-T6活化　　Real-time PCR结果显示，与HTP孵育细胞相比， HTPK25处理的HSC-T6中，collagen I和α-SMA mRNA表达水平明显减低。Western blotting结果与之一致，HTPK25能够在HSC-T6中抑制collagen I和α-SMA的蛋白表达。表明HTPK25可抑制HSC-T6活化，减少胶原分泌，具有抗肝纤维化作用。　　结论：肝星状细胞特异性细胞穿透肽与前凋亡肽嵌合体HTP25能够以时间依赖和剂量依赖的方式诱导大鼠肝星状细胞HSC-T6凋亡并抑制其细胞活力、破坏其线粒体结构，从而抑制其活化，减少胶原分泌，发挥抗肝纤维化作用。