论文部分内容阅读
中华鳖(Pelodiscus sinensis)属于爬虫纲龟鳖目,是古老的次水生爬行动物,作为变温羊膜腔动物,是变温无羊膜动物到恒温羊膜腔动物进化的联接点,对于系统发育学的研究有较高的科研价值。同时,中华鳖作为一种高营养,高经济附加值的水产品,在东南亚地区、特别是中国,其养殖规模逐年扩大,疫病也呈现逐年上升的趋势。由于对中华鳖及其病原学的基础研究相对滞后,疫病防控的措施也相对缺乏,在中华鳖养殖中也曾出现了抗生素和违禁药物滥用乱用等现象,导致药物残留等安全问题。本研究通过对IL-1β与TLR4基因的克隆研究,旨在探明它们与其他脊椎动物之间的差异,为中华鳖疾病防控,生理状态监控等提供研究基础和依据。同时探讨了枯草芽孢杆菌对于中华鳖免疫相关基因、肠道菌群以及生产性能的影响。1.中华鳖IL-1β的基因克隆,功能鉴定以及成熟肽切割位点的确定克隆和鉴别了中华鳖IL-1β分子(tIL-1)。序列分析结果表明,tIL-1β的cNDA全长1529 bp,包含一个61 bp的5’UTR,831 bp,编码277个氨基酸的ORF和637bp的3’UTR, tIL-1βmRNA的3’UTR的GC含量高于已知的IL-1β。tIL-1β含有IL-1家族特征序列,结构预测表明,tIL-1β的C端为一个由12个β折叠组成IL-1特征结构—β三叶草(p-trefoil)结构；同源性分析表明,tIL-1β与来自鸟类的IL-1β最为接近,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为为46.7%和58.4%。中华鳖人工感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后,tIL-1β的mRNA转录水平在不同组织内均有上升,脾脏中表达量最高,在感染后6h提高20倍。通过在HEK293细胞中共表达tIL-1β和 tcaspase-1,缺少经典的哺乳动物特有的ICE (Interleukin-1β cut enzyme)位点的tIL-1β能够被tcaspase-1切割。对可能切割的天冬氨酸位点进行突变,确认D130为tIL-1β的ICE位点。通过杆状病毒表达系统表达的tIL-1p成熟肽刺激中华鳖外周血单核／巨噬细胞(PBMo)可提高tIL-1β、COX-2等炎症相关基因mRNA的转录水平,说明tIL-1β具有类似哺乳动物的生物学功能。2.中华鳖Toll样受体4的克隆和功能鉴定TLR4是Toll样受体家族成员之一,能够识别革兰氏阴性菌细胞壁上的脂多糖成分(Lipopolysaccharide, LPS),并通过MyD88依赖和MyD88非依赖信号通路,诱导炎症相关蛋白和干扰素的产生。研究克隆并鉴定了来自中华鳖的TLR4分子(tTLR4)的cDNA全长序列,tTLR4全长3396bp,ORF长为2502bp,编码一个833个氨基酸的蛋白。在蛋白质组成结构上,由3个部分组成,分别为亮氨酸重复序歹(Leucine-rich repeat, LRR)和亮氨酸重复序列C端(LRRCT)组成的胞外区域,I型跨膜结构域以及胞内的TIR (Toll-IL-1 receptor domain)结构域。通过与其他脊椎动物TLR4基因的氨基酸和核苷酸序列相似度比较,以及基因组的邻近基因组成分析显示,tTLR4与哺乳动物,禽类的TLR4较为接近。嗜水气单胞菌感染后中华鳖的血液和脾脏中的tTLR4 mRNA转录水平显著上升。PBMo经100ng/ml的LPS刺激后,细胞中IL-1β,COX-2,以及tTLR4基因的mRNA水平显著上升。构建的稳定表达tTLR4的HEK293细胞经不同浓度的LPS刺激后,通过双荧光素酶实验检测发现,tTLR4可激活NF-κB启动子,但不能激活IFN-β启动子。研究结果显示,tTLR4是哺乳动物和禽类TLR4的直系同源基因,具有与哺乳动物类似的生物学功能,并能通过MyD88-依赖途径启动中华鳖机体的免疫反应。3.枯草芽孢杆菌对中华鳖肠道菌群,消化酶活以及免疫相关基因的影响研究了本实验室筛选得到的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对中华鳖生产性能,肠道微生态以及部分免疫相关基因的表达影响。中华鳖作为非模式动物,缺少各类模式相关(pattern recognition receptor, PRR)受体序列信息,借助于外周血转录组的De novo拼接得到的转录本,获得了12条Toll样受体基因(TLR)。饲养实验结果表明,饲料中添加枯草芽孢杆菌能够显著提高中华鳖体重,降低饲料转化率,提高肠道内的消化酶酶活。利用454测序对肠道菌群进行分析表明,中华鳖肠道的中厚壁菌门为主要优势菌群,而枯草芽孢杆菌处理后,厚壁菌的比例进一步增加,并且拟杆菌,变形门菌等革兰氏阴性菌几乎消失。利用荧光定量对肠道免疫基因进行检测发现,枯草芽孢杆菌降低炎症相关基因以及部分Toll样受体的表达。利用体外的外周血单核/巨噬细胞(PBMo)模型发现枯草芽孢杆菌对于炎症基因的激活能力低于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),并且对嗜水气单胞菌引起的炎症反应具有一定的抑制作用。以上结果表明,日粮中添加枯草芽孢杆菌能够调整中华鳖肠道菌群结构,降低炎症基因的表达,缓解肠道应激,促进其生长。