论文部分内容阅读
前言 DNA疫苗是将编码目的抗原的基因以真核细胞重组表达载体的形式经各种转移途径转入机体细胞，借用宿主细胞的加工，表达抗原分子，进而激活机体的免疫应答。其优点为：可以模拟活病原体自然感染过程，不断表达具有较强免疫原性的抗原蛋白；易于精选所需基因片段，有的放矢地激发机体的免疫应答；诱导机体产生持久而强烈的体液和细胞免疫应答。以减毒伤寒杆菌菌苗(Salmonella typhimurium)(沙门氏菌属)作为裸DNA的运载体制备的口服DNA疫苗可以激发机体的粘膜免疫应答和全身免疫应答。但至今，尚未见有关口服DNA疫苗对肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocyte，iIEL)影响的研究报道。 iIEL是存在于消化道粘膜上皮组织细胞间或上皮细胞与基底膜相接处的一群异质性淋巴细胞。这群细胞在消化道的数量极其庞大(5-7×10~7／鼠)，构筑了抗感染的第一道免疫防线。在发育场所、亚群构成、细胞表型和抗原识别等多方面，iIEL与外周血及淋巴样组织中的T细胞均有所不同。小鼠的iIEL主要由CD8~+ T细胞(CD8~+ CTL)构成，其中TCRγδ和TCRαβCD8αα两种表型的T细胞亚群存在比例明显高于其它部位的淋巴组织；iIEL表达有限数量的特异性TCR受体库，并以MHC非限制性的方式识别抗原分子。近几年来，本实验室对iIEL的生物学活性进行了系统研究，发现活化的iIEL主要分泌Th1型细胞因子，同时，转化能力及杀伤活性也显著增强。据文献报道，FasL是介导iIEL发挥杀伤功能的主要效应分子。因此，在上述研究的基础上，本实验通过口服减毒伤寒杆菌菌苗运载的Ag85A DNA疫苗免疫小鼠，用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从基因水平上检测粘膜免疫系统中iIEL FasL的表达，分析口服DNA疫苗对iIEL FasL mRNA表达的影响。同时观测外周免疫系统中脾淋巴细胞FasL mRNA的水平变化，比较iIEL和脾淋巴细胞对口服DNA疫苗的反应性差异，以进一步完善对iIEL生物学功能的认识。实验材料和方法 按照UNIQ一10柱式质粒小量抽提试剂盒(EZ Svin colunm Plas而dM面一P此那众)说明从减毒伤寒杆菌菌苗中提取A薛SA一VIJns.企A质粒，然后用B班I限制性内切酶消化质粒，经琼脂糖凝胶电泳鉴定A郎5人基因片段的存在。 C57BL/6小鼠30只，6一8周龄，随机分成3组:①运载Ag85A-vljns.企A质粒的减毒伤寒杆菌组(A邵5 A DNA质粒组)12只;②运载空质粒(VIJns.企A)的减毒伤寒杆菌组(空质粒对照组)12只;③正常对照组6只。A那SA DNA质粒组和空质粒对照组小鼠经口灌饲100闪含1 xl护C几菌苗的0.ZM NaHC仇/鼠，共免疫三次，每次间隔两周，分别于末次免疫后的第1、3、5、8天颈椎脱位处死各组小鼠3只，收集iIEL和脾淋巴细胞。按照RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit)说明提取iIEL和脾淋巴细胞的总RNA。用UV300紫外分光光度计测定总RNA的纯度及浓度。以总RNA为模板合成第一链cDNA，再以cDNA为模板，以管家基因p一actin为内参照，PCR扩增小鼠FasL基因片段。扩增产物经1 .0%的琼脂糖凝胶电泳和澳化乙锭染色后用Che而Itnager55的凝胶成像分析仪进行扫描分析。FasLmRNA的表达水平用所测定的扩增产物FasL的电泳条带密度与日一actin电泳条带密度的比值来表示，并利用SPSS n.oforwindows统计软件对FasL mRNA水平变化进行显著性分析。实验结果 1，提取的质粒中Ag85A基因片段的鉴定: 从运载Ag85A一V IJns.tPA质粒的减毒伤寒杆菌菌苗中提取的质粒经B四限制性内切酶消化，然后经0 .8%琼脂糖凝胶电泳并扫描，显示质粒中存在A娜SA的基因片段(1014坤):， 2.口服A沙SA DNA疫苗对小鼠iIEL FaSL mRNA表达的影响: 末次DNA免疫后第8天，Ag85 A DNA质粒组iIEL FaSL mRNA平均表达水平(0.以巧7，0.25325)分别较正常对照组(0.1925士0.12580)和空质粒对照组(0.2833土0.伽打37)高(P<0.05)，而空质粒对照组与正常对照组相比，FasL mRNA的平均表达水平未见有意义的变化(P>0.05)。这提示口服的DNA疫苗能够上调iIEL Fasl.mRNA的表达。 3.口服Ag85A DNA疫苗对小鼠脾淋巴细胞FasL mRNA表达的影响: 末次DNA免疫后，A沙SA DNA质粒组与空质粒对照组、正常对照组之间相互比较，脾淋巴细胞FasL mRNA的表达水平均未见显著性差异(P>0.05)。这表明口服A娜SA DNA疫苗后，小鼠脾淋巴细胞FasL mRNA的表达未出现有意义的变化。讨论 A沙5复合物由分子量为30一32kDa的A郎SA、A沙SB和A郎SC三种蛋白质组成，是结核分枝杆菌(M.tubereulosis)分泌蛋白和BCG培养滤液的主要成分。其中以A娜SA为基础制备的DNA疫苗可诱导强烈的Thl型细胞免疫应答和CDS+T细胞介导的细胞毒效应;以阳离子质脂为载体，或用肌肉电穿孔法(musde electroporation)进行基因免疫，分别增强了抗原提呈细胞的提呈能力和质粒DNA的免疫原性，收到了良好的免疫效果。 本实验利用减毒伤寒杆菌菌苗运载的A必SA DNA疫苗经口免疫小鼠，观察了口服DNA疫苗对粘膜免疫系统中iIEL FasL mRNA表达水平的影响。结果提示口服的A娜SA DNA疫苗能够上调iIEL FasL mRNA的表达。