鲤疱疹病毒Ⅱ型极早期基因筛选及病毒感染对活性氧相关信号通路的影响

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我国是鲫鱼养殖大国,自鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2)在中国爆发以来,该病毒对鲫鱼养殖业造成巨大危害,对于该病毒的深入研究是迫切的。鲤疱疹病毒Ⅱ型是双链DNA囊膜病毒,病毒的的基因组在扩增过程中有明显的表达时序性。其中能够利用宿主已有的RNA聚合酶等蛋白酶,在宿主内无新蛋白合成的情况下进行表达的基因是病毒极早期基因。病毒极早期基因及其表达的极早期蛋白能够影响病毒基因和宿主基因的表达,调控病毒扩增速率和宿主蛋白表达为病毒扩增创造条件,是病毒感染过程的关键调控基因。极早期基因作为病毒基因组中最先表达的基因,是非常有潜力的防控药物筛选靶点。同时可以以极早期基因作为代表基因,监测病毒复制扩增情况。其启动子也是高效启动子的优秀备选。筛选得到的CyHV-2极早期基因能够为后续对该病毒的研究提供准确的数据。根据已有研究发现病毒感染会引起细胞内ROS变化。ROS的变化是病毒感染过程的一个重要变化指标,它随着病毒性疾病病理进程的推进而增多,而细胞为了维持胞内氧化平衡会激活抗氧化应激相关基因的表达,调控免疫系统抵御病毒侵染。目前还没有有关CyHV-2感染后宿主内活性氧通路变化的研究。为了更进一步了解病毒侵染过程中氧化应激系统的变化进行了检测和探究。通过实验我们得到以下结果:1、建立了使用12微克每毫升放线菌酮和300微克每毫升阿糖胞苷共同作用的CyHV-2极早期基因筛选模型。通过高通量测序及验证,筛选得到了ORF54、ORF121、ORF141、ORF147、ORF155五个CyHV-2极早期。以及早期基因34个,晚期基因38个。2、通过检测细胞内ROS发现,CyHV-2感染会引起宿主内ROS升高,并且呈现先升高后下降的变化趋势。同时发现CyHV-2能够上调NADHP氧化酶亚基NOX4相关基因的表达,促进ROS生成。同时CyHV-2的持续感染会引起细胞内ROS累积,激活Nrf2/ARE抗氧化反应元件相关基因的表达,清除细胞内过度累积ROS。3、为了探究CyHV-2感染与宿主活性氧生成相关基因的相互作用,使用抗氧化剂EGCG和BBH处理Ryu F-2细胞,再用CyHV-2病毒感染该细胞。进一步检测氧化应激通路相关基因的变化以及ROS的变化。实验发现BBH和EGCG能够有效抑制CyHV-2在细胞内的转录和扩增。同时抑制由CyHV-2感染上调的NAPDH酶相关基因的表达,以及ROS生成。随感染时间增加,BBH和EGCG能显著上调Nrf2基因的表达,调控Nrf2/ARE抗氧化元件抑制细胞内ROS升高。结果表明,BBH和EGCG能够通过抑制ROS生成,进而抑制CyHV-2的扩增,也说明ROS是CyHV-2扩增的重要信号分子。
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