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实时荧光PCR作为重要的分子生物学技术,以其简便、快速、准确、无需PCR后处理、易于自动化等优点,广泛应用于生物学和医学领域。但是PCR反应中的非特异扩增是进一步提高PCR灵敏度和特异性的最大阻碍。故而我们对针对PCR非特异扩增的引物设计策略进行了比较研究。第一章,阐述了 PCR反应中的非特异扩增的类型及其各自形成原因、影响和解决方式,提出了本论文的研究目的和研究内容。第二章,我们比较了 DPO技术和HAND系统在单重和多重PCR反应中抑制引物二聚体的效果,发现HAND系统抑制引物二聚体的效果更好,但是会抑制较短的目的片段的扩增。考察了 HAND系统对不同长度目的片段的影响,HAND系统对小于310bp的目的片段的抑制程度比较大。故而考察了不同Tag和退火温度,使用比加尾引物所用的尾巴序列的5’端少几个碱基的Tag,退火温度采用先低(根据加尾引物的特异序列的退火温度来决定)后高(与Tag序列的Tm值接近,但不能大于等于Tag序列的Tm值)时能提高靶标扩增效率而又不减弱抑制引物二聚体的效果。最后Tag序列自身有可能会产生非特异产物,在使用HAND系统时最好先考察Tag序列自身是否会产生非特异产物。第三章,在第一节中比较了能够提高引物3’端特异性的五种类型引物:SuperSelective 引物、DPO 引物、ARMS 引物、Looping out 引物和 DPO-A 引物。发现SuperSelective引物、Looping out引物以及引入了错配的ARMS引物的特异性比较好。接着比较了这三种引物的最低检测限和特异性,SuperSelective引物和引入错配的ARMS引物的最低检测限能够达到3拷贝,选择性达到0.01%,Looping out引物的最低检测限为30拷贝;选择性为0.05%。在第二节中,结合二维标签技术考察了 SuperSelective引物在检测点位置相近以及相隔较远的情况下进行多重检测的可行性。