镉（Cd）是一种广泛存在的环境污染物,通过食物链在动物与人体内长期累积。骨骼是Cd的主要靶器官之一,长期镉暴露影响骨稳态,并最终导致骨质疏松的发生。正常情况下,成骨细胞进行骨形成和破骨细胞进行骨吸收之间的动态平衡维持骨稳态,骨稳态除了机体的自我调节机制外,氧化应激、DNA损伤、衰老、雌激素等外源性因素也参与其中。SIRT1抑制导致机体ROS的大量产生在多种疾病的发展和治疗中发挥重要作用,主要包括代谢性疾病和衰老相关疾病。然而SIRT1在Cd暴露致骨质疏松的发生以及在成骨细胞中的作用机制尚不明确。本研究分别通过建立大鼠成骨细胞SIRT1过表达体外模型和大鼠SIRT1过表达体内模型,使用流式细胞术、透射电镜、Western Blotting、免疫共沉淀、免疫荧光法、免疫组织化学等实验技术,检测成骨细胞氧化应激和细胞损伤等相关指标,从分子水平揭示SIRT1在镉致大鼠骨质疏松中的分子机制,为防治镉对骨骼的毒性损伤提供新的理论依据。主要研究内容如下:1.镉致大鼠成骨细胞发生氧化应激损伤以大鼠成骨细胞系ROS1728细胞为研究对象,通过不同浓度镉（0、20、40、80μmol/L）暴露12 h,或NAC（10μmol/L）预处理12 h后与40 μmol/L镉共处理12 h。进行以下试验:①通过流式细胞术检测镉暴露对成骨细胞内ROS、线粒体ROS水平,以及MDA含量与SOD活性;②透射电镜观察线粒体形态结构变化,流式细胞术检测线粒体膜电位的变化,Western Blotting检测线粒体蛋白Cyto-C、UCP2、SOD2表达水平;③测定线粒体PINK1、Parkin蛋白表达量,流式细胞术检测线粒体自噬率,同时免疫荧光法检测Tom20与LC3蛋白共定位情况;④检测线粒体Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白表达量,Annexin/PI 染色检测细胞凋亡率;⑤彗星试验观察细胞DNA拖尾现象,同时测定核蛋白ATM、p-ATM、Ace-P53、P53、γ-H2AX蛋白表达量;⑥建立SIRT1过表达成骨细胞株,Western Blotting检测核蛋白SIRT1、PCG-1α蛋白表达水平。结果表明,①40μmol/L与80μmol/L镉暴露12 h后,成骨细胞内ROS与线粒体ROS生成极显著增加（p＜0.01）,MDA含量显著或极显著升高（p＜0.05或p＜0.01）,SOD活性显著或极显著下降（p＜0.05或p＜0.01）;10 μmol/LNAC极显著抑制镉暴露致成骨细胞内ROS的生成（p＜0.01）,并显著降低线粒体ROS的生成（p＜0.05）;MDA含量显著降低（p＜0.05）,SOD活性显著增加（p＜0.05）。②40μmol/L镉暴露导致成骨细胞线粒体肿胀,线粒体嵴断裂、模糊不清、线粒体膜电位极显著降低（p＜0.01）,同时形成线粒体自噬小体;线粒体蛋白Cyto-C、UCP2、以及SOD2显著或极显著上调（p＜0.05或p＜0.01）;NAC有效缓解镉暴露致成骨细胞线粒体形态结构的改变,线粒体膜电位极显著上升（p＜0.01）,线粒体蛋白Cyto-C、UCP2、以及SOD2表达水平显著或极显著降低（p＜0.05或p＜0.01）。③镉暴露极显著上调线粒体PINK1、Parkin蛋白表达量以及Tom20与LC3共定位水平,线粒体自噬率极显著增加（p＜0.01）:NAC有效抑制镉暴露致成骨细胞线粒体自噬的发生。④40 μmol/L镉暴露极显著上调线粒体蛋白Cleaved Caspase-3、激活Cleaved Caspase-9、Bax/Bcl-2蛋白（p＜0.05或p＜0.01）,细胞凋亡率均极显著增加（p＜0.01）;NAC显著或极显著下调镉暴露致成骨细胞Caspase依赖的内源性凋亡发生（p＜0.05或p＜0.01）,细胞凋亡率显著降低（p＜0.05）;NAC有效上调镉暴露致SIRT1蛋白表达的抑制,同时极显著降低PGC-1α、PINK1、Parkin蛋白表达量以及Tom20与LC3共定位水平（p＜0.01）。⑤镉暴露导致细胞DNA断片迁移极显著增多,尾部DNA含量极显著增加（p＜0.05）,同时ATM与H2AX蛋白磷酸化水平、Ace-P53、P53蛋白表达量极显著增加（p＜0.01）;NAC极显著降低DNA断片迁移（p＜0.01）,显著降低尾部DNA含量（p＜0.05）;同时ATM与H2AX蛋白磷酸化水平、Ace-P53、P53蛋白表达量极显著降低（p＜0.01）。⑥随着镉浓度的增加,SIRT1蛋白表达水平极显著被抑制,同时极显著下调PGC-1α蛋白表达水平（p＜0.01）;而SIRT1过表达极显著抑制镉暴露对PGC-1α蛋白的激活（p＜0.01）。以上结果表明镉暴露引起成骨细胞发生氧化应激损伤,包括激活Caspase依赖的线粒体内源性凋亡的发生、PINK/Parkin介导的线粒体自噬、以及ATM介导的DNA损伤应答,同时镉暴露抑制成骨细胞SIRT1蛋白表达,并激活下游蛋白PGC-1α。2.SIRT1抑制镉暴露致成骨细胞氧化应激损伤中的作用为了进一步探究SIRT1在镉暴露致成骨细胞氧化应激中的作用,建立了 SIRT1过表达成骨细胞株。结果显示,SIRT1过表达显著降低镉暴露致成骨细胞ROS、线粒体ROS、MDA含量及SOD活性（p＜0.05）。与镉暴露组相比,SIRT1过表达与镉共处理组成骨细胞线粒体生成增多,线粒体嵴排列整齐,结构清晰可见;线粒体内膜蛋白Cyto-C、UCP2、SOD2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白表达极显著降低（p＜0.01）,细胞凋亡率极显著降低（p＜0.01）,PINK1与Parkin蛋白表达水平、P53乙酰化水平极显著降低（p＜0.01）,P53蛋白表达水平极显著降低（p＜0.01）、ATM与H2AX蛋白磷酸化水平极显著下调（p＜0.01）,尾部DNA含量极显著减少（p＜0.01）DNA拖尾现象显著所减少（p＜0.05）。以上结果表明SIRT1抑制激活ATM介导的DNA损伤应答,同时激活PINK1介导的线粒体自噬与Caspase依赖的线粒体内源性凋亡的发生,是镉暴露致成骨细胞氧化应激损伤的主要原因。3.SIRT1抑制在镉暴露致大鼠骨质疏松发生中的作用机制为了进一步探究SIRT1抑制在镉暴露致骨质疏松发生中的作用机制,本研究建立SIRT1过表达大鼠模型,同时双侧卵巢摘除法建立骨质疏松模型,通过饮水中添加NAC和CdCl2,为期18个月,建立NAC抗氧化与镉暴露大鼠骨质疏松模型。结果显示,镉暴露导致大鼠血清ROS、MDA含量极显著升高（p＜0.01）,SOD活性极显著降低（p＜0.05或p＜0.01）。NAC以及SIRT1过表达有效降低了镉暴露导致的ROS、MDA含量的升高以及SOD活性的降低（p＜0.05或p＜0.01）。与对照组相比,镉暴露组骨相关参数BV/TV、Tb.Th、Tb.N和BMD显著降低（p＜0.01）,Tb.Sp、SMI值显著升高（p＜0.01）;对照组骨组织微观结构完整,镉暴露组骨小梁数量减少,骨小梁分离度增大,骨髓腔面积增大,骨吸收陷窝增大（p＜0.01）。与镉暴露组相比,NAC预处理组与SIRT1过表达组大鼠骨相关参数有所好转,骨小梁排列较为整齐,骨小梁分离度变小,骨髓腔面积增多,骨吸收陷窝变小。Western Blotting与免疫组织化学结果显示,镉暴露组大鼠骨组织线粒体内膜蛋白Cyto-C、UCP2以及SOD2蛋白表达水平极显著升高,内源凋亡相关蛋白Cleaved casp-3、Cleaved casp-9、Bax与Bcl-2蛋白表达水平比值极显著升高（p＜0.01）。与镉暴露组相比,NAC与SIRT1过表达显著或极显著抑制线粒体内膜蛋白Cyto-C、UCP2以及SOD2蛋白表达水平以及内源凋亡相关蛋白Cleaved casp-3、Cleaved casp-9、Bax与Bcl-2蛋白表达水平（p＜0.05或p＜0.01）。与对照组相比,镉暴露组大鼠骨组织SIRT1蛋白表达水平极显著降低（p＜0.01）,PGC1-α蛋白表达水平极显著升高（p＜0.01）。与镉暴露组相比,NAC与SIRT1过表达组大鼠骨组织SIRT1蛋白表达水平极显著上调（p＜0.01）,PGC1-α蛋白极显著降低（p＜0.01）。同时镉暴露组大鼠骨组织PINK1、Parkin蛋白表达水平极显著升高（p＜0.01）。与镉暴露组相比,NAC与SIRT1过表达组大鼠骨组织PINK1、Parkin蛋白表达水平极显著降低（p＜0.01）,Tom20与LC3蛋白共定位水平显著降低（p＜0.01）。与对照组相比,镉暴露组大鼠骨组织ATM、H2AX蛋白磷酸化水平极显著增加（p＜0.01）,P53蛋白表达水平以及P53乙酰化水平极显著增加（p＜0.01）。与镉暴露组相比,NAC与SIRT1过表达组大鼠骨组织ATM、H2AX蛋白磷酸化水平极显著降低（p＜0.01）,P53蛋白表达水平以及P53乙酰化水平极显著降低（p＜0.01）。以上结果表明,镉暴露致大鼠骨组织SIRT1抑制,激活ATM介导的DNA损伤应答、Caspase依赖的线粒体内源性凋亡、以及PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,是导致骨组织氧化损伤是镉暴露致骨质疏松发生的主要原因,而SIRT1过表达能有效缓解镉暴露致大鼠骨组织氧化应激损伤与骨质疏松的发生。综上所述,镉暴露抑制SIRT1,激活ATM介导的DNA损伤应答、Caspase依赖的线粒体内源性凋亡、以及PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,导致大鼠成骨细胞与骨组织发生氧化应激损伤,最终导致大鼠骨质疏松的发生,因此SIRT1可能作为预防和治疗镉骨骼毒性以及骨质疏松的作用靶点。