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猪肉是人类重要的动物性食品,猪肉中所含多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)大部分为ω-6 PUFAs,而对人体健康有重要价值的ω-3 PUFAs含量较少。本研究利用体细胞核移植技术首次成功生产了转ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)克隆猪,结果如下:实验一:采用组织块培养法,建立了7个38日胎龄的纯种英系大白猪胎儿成纤维细胞系;细胞接触抑制2 d后,经流式细胞术检测发现, 80%以上的细胞处于G0/G1期。实验二:利用脂质体介导的方法,将sFat-1基因转染至大白猪胎儿成纤维细胞,并对细胞的转染及筛选条件进行了优化。通过大白猪胎儿成纤维细胞对G418敏感性检测发现,600μg/mL的G418可以在7 d内将细胞全部杀死,因此筛选时选择该浓度较为合适。比较了脂质体采用与DNA的比例分别为10μL : 3μg、10μL : 4μg、10μL : 6μg和10μL : 7μg时的转染效率,其中脂质体与DNA的比例控制在10μL:4μgm时,筛选后所得细胞克隆数最高(20个);对筛选出的G418抗性细胞克隆中状态较好的18个进行了PCR及RT-PCR检测,PCR检测结果显示:18、3、6、12、16及17号克隆点细胞,为转基因阴性细胞;再利用RT-PCR对剩余12个PCR阳性克隆点的细胞进行RNA表达水平检测,结果4号克隆点的RNA表达量极低,认定其为转基因阴性,其余11个为阳性。实验三:为了提高克隆胚胎的发育能力,将卵巢上的卵泡按直径分为大卵泡(直径4-6 mm)及小卵泡(直径2-3 mm)两组,体外成熟38 - 42 h后作为胞质受体,以胚胎的卵裂率和囊胚率为检验标准,评价卵泡大小及成熟时间(卵龄)对卵母细胞成熟质量的影响;胚胎辅助激活上,比较了胚胎辅助激活采用电激活和CHX化学激活对胚胎发育的影响。结果,卵龄40 h的大卵泡卵母细胞的囊胚发育率(19.3±1.7%,P < 0.05)显著高于其它各组,42 h的小卵泡卵母细胞的囊胚率次之(11.0±1.3%);CHX化学辅助激活能提高胚胎的囊胚率,并且能够显著提高小卵泡胚胎的囊胚发育率(P < 0.05),但大卵泡组胚胎囊胚率未见显著提高。实验四:以鉴定为转基因阳性的细胞为核供体,体外成熟的卵母细胞为胞质受体构建克隆胚胎,胚胎经体外培养后进行胚胎移植,共移植1889枚1-4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠(90%),7头妊娠足月(70%)分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1.1%(出生仔猪/移植胚胎)。对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87%。RT-PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat-1基因。上述结果表明,利用SCNT可以有效的生产转基因猪,并且通过对供体细胞的转染、筛选及鉴定,可使转基因效率达到较高水平。转sFat-1基因克隆猪的诞生,为探索通过转基因手段改善猪肉品质奠定了坚实的基础。